指纹图谱技术在中药制剂研究中的应用

【摘要】  　　概述了中药指纹图谱技术在中药制剂研究中对于投料药材甄别、炮制工艺优化、监控生产工艺、质量控制等方面的应用，以及制剂谱效结合、指导新药研发方面的应用，展望了指纹图谱技术在中药制剂研究开发应用中的前景。

【关键词】  中药指纹图谱技术 制剂研究
　
　　Abstract：This article reviewed the applications of fingerprint technology in preparation research of Chinese medicine, such as screening of the materia medica, optimization of processing technology, monitoring the production technology and quality control of the finished product. The combination of effect and chromatographic fingerprint, guidance in research and development of new drug were also reviewed. It gives a good prospect of application of fingerprint technology in preparation research of Chinese medicine.

　　Key words：Fingerprint of traditional Chinese medicine;  Preparation research

　　随着近年来“回归”的潮流在世界各国日益盛行，中药与天然药物受到国际医药界的广泛关注，成为研究开发的热点。虽然我国有几千年应用中药的，但中药产业总体上仍处于较初级的阶段，中成药类贸易逆差显著，缺乏高附加值产品和优势品种。缺乏“符合中药特点同时又被国际社会认可的质量标准和规范化的质量控制体系”成为制约中药化事业的深入发展、制约我国传统中药产品进入国际医药大市场的瓶颈之一。因此,加强对中药制剂的质量控制,寻找一种切实可行的质控方法成为当前中药发展中亟待解决的问题。应用指纹图谱技术对中药进行质量控制是当前我国中药研究的一个热点,也是中药未来发展的一个方向。中药制剂，如何吸收指纹图谱技术的精髓，将其用于自身发展，是一个值得思考的问题。本文就指纹图谱技术在中药制剂研究中的应用作一综述。

　　1  指纹图谱技术在中药领域的研究现状

　　1.1  中药指纹图谱的检测方法中药指纹图谱技术主要是指采用光谱和色谱等技术，获得组分群体的特征图谱或图像，并结合机技术对所获得的资料进行分析，通过适当的数据处理方法对图谱进行“过滤”和简化，获得专属、稳定、实用的特征数据，从而对药物的真伪进行鉴别以及对药物质量进行控制。中药指纹图谱按测定手段分类可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱，而化学（成分）指纹图谱在中药制剂分析研究方面应用尤为广泛，根据在研究中所使用的具体方法与技术的不同，主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效毛细管电泳色谱法(HPCE)、高效逆流色谱法(HSCCC)、X射线衍射法（XRD）、X射线荧光光谱法（XRF）等。同时，联用技术是目前最受重视的手段,HPLC/MS，HPLC/UV，HPLC/NMC，HPLC/MS/MS等联用技术给中药分析带来了崭新的前景,指纹图谱也达到多维、多息阶段。

　　1.2  中药指纹图谱信息的处理方法中药指纹图谱的数字化可以地进行图谱的比较,实际应用中借助于化学计量学和计算机技术将数字化指纹图谱的数字编制成软件以供使用。目前中药指纹图谱的计算机解析方法有人工神经法、欧氏距离、绝对距离、Minkowsky距离、相关系数法、峰匹配度及夹角余弦法等。这些方法都有各自的特点和应用范围，如何针对实际问题在实际应用中选用合适的相似度评价方法，使中药指纹图谱的评价更加科学、客观、准确，是亟需解决的问题。为此，学者们进行了相关研究。程翼宇等［1］根据指纹图谱色谱峰峰数弹性、峰比例同态性和峰面积同态性等3个指标组成的相似度测量评价方法，考察了以上相似度测度，并计算不同批次参麦注射液产品指纹图谱相似性，结果表明夹角余弦测度适于分析评价不同批次间药品质量的稳定性。聂磊等［2］则发现夹角余弦、相关系数、Nei系数较适用于中药品种的鉴定，对于组成中药用量的比例不变，但其总量变化的情况，距离系数和改进的Nei系数较能体现，故较适用于与总量有关的中药及中药材的质量分析。

　　2  指纹图谱技术在中药制剂研究中的应用

　　2.1  在投料药材真伪甄别、质量评价的应用投料药材的质量优劣可直接影响制剂的质量，因此建立完善、全面评价中药材质量的标准显得犹为重要。我国中药材种类众多，同名异物、一物多名的现象极为常见，这为中药材的真假甄别带来困难。加之药材市场假货横行,混淆品、伪品屡见不鲜，如果没有合适的评价中药材质量的方法，很容易影响中药制剂的质量，甚至造成临床用药的不安全性。针对这种情况，国家鼓励具道地性药材的地区建立中药材GAP基地，种植优质、规范的中药材，并号召中药行业进行中药材指纹图谱的研究，建立药材的指纹图谱特征库，以规范全国药材质量。迄今为止，大部分中药材已建立了指纹图谱评价方法，为制剂投料药材的真伪甄别、质量评价提供了依据。

　　2.2  在药材炮制工艺优化中的应用中药的药效往往在炮制后才能显现出来，不同的炮制方法对药物的性味、归经、作用、毒性均有影响。只有选择合适的炮制方法，把握恰当的炮制技巧，才能使中药的药效得到体现。传统的炮制标准大多依赖感官经验，缺乏严格、客观的指标，对炮制前后药物化学成分的变化缺乏分析，对炮制工艺过程中的技术参数的控制缺乏科学的解释。由于中药成分复杂，配伍后的化学成分的变化就更加复杂。因此,很难找到确切的有效成分作为分析指标。指纹图谱技术的引入为炮制质量标准的建立、炮制工艺的指导提供了科学依据。许腊英等［3］采用RAPD技术对不同产地的茅苍术炮制前后进行DNA指纹图谱研究，发现不同产地的茅苍术生品DNA指纹图谱一致，炮制前后DNA指纹图谱发生了较大变化，几种炮制品之间也存在不同程度差异，说明炮制工艺对药材DNA分子鉴定有较大影响，可将DNA指纹图谱技术用于中药炮制品的质量标准研究。赫炎等［4］采用HPLC指纹图谱定量分析及多变量多因素分析，考察虎掌南星炮制加工中的矾水浓度、浸泡时间及矾水温度对虎掌南星饮片物质基础的影响，得到温度对虎掌南星指纹图谱有显著影响的结论，提出应尽量在春秋季节的温度环境炮制虎掌南星。李娆娆等［5］考察制炭温度及受热时间对中药槐花高效液相指纹图谱的影响，指出槐花制炭温度以(185±2)℃，加热30 min为宜，为槐花炭炮制工艺的规范化研究提供了实验数据。中药制剂整体作用的发挥有赖于方中各中药饮片作用的发挥，只有有效控制中药饮片的质量，才能生产出质量稳定、安全有效的中药制剂。中药指纹图谱在实现对中药饮片进行科学、客观、公正、有效的质量控制及指导炮制工艺改革方面将起到越来越重要的作用。

　　2.3  在监控生产工艺中的应用生产工艺不稳定是引起中药制剂质量不稳定的重要因素之一，只有建立科学的生产工艺评价方法，指导工艺的优化，才能保证成品质量稳定。现今评价生产工艺的优劣往往以某单一化学成分的含量或药材浸出物的总量为主要指标，但此类指标均无法全面表征制剂半成品的组成特征。近年来学者们纷纷把目光投向指纹图谱技术，将指纹图谱技术应用于制剂工艺研究，利用指纹图谱的全面性与完整性追踪工艺过程，找出敏感环节加以控制，进而确保成品质量的稳定。王冬梅等［6］建立了贯叶连翘提取物的HPLC-UV-MS指纹图谱分析方法，选取提取物中的lO个主要成分色谱峰作指标，考察了提取工艺对有效成分的富集程度、工艺的批内和批间稳定性以及抗氧化剂与药材采收方法对提取物中金丝桃素类、贯叶金丝桃素类和黄酮类化合物等主要成分含量的影响。姚仲青等［7］采用指纹图谱监控赤芍总苷提取精制工艺，比较不同除杂方法对赤芍指纹图谱的影响，优选出氧化镁吸附除鞣质的处理方法。胡楚楚等［8］提出一种基于指纹图谱分析技术的中药提取工艺稳定性评价方法，通过单因素实验，获取实验条件(如溶剂倍数、溶剂浓度、提取时间和提取次数等)变化时的红参提取液色谱指纹图谱。比较并选取基于欧式距离计算方法的相似性测度计算指纹图谱相似度值，并且在所得实验数据的基础上，应用3次样条函数对相似度、工艺参数特性曲线进行拟合，实验结果表明以指纹图谱相似度为指标可定量考察样品色谱指纹图谱与工艺参数之间的关系，较灵敏地表征了提取工艺参数波动导致的药材提取物整体质量变化情况，并可用于指导工艺参数的调整，优于传统的以单一化学成分含量为指标的工艺评价方法。苏薇薇等［9］采用指纹图谱技术监控田基黄注射液的生产过程, 根据生产中各化学成分的变化趋势，有针对性地对生产工艺中的敏感步骤进行严格控制,可使生产过程更加科学、合理。

　　2.4  在成品质量控制中的应用指纹图谱针对中药多成分的特点，能全面、系统地反映中药的整体特征，在中药制剂质量控制的应用中显现了很大的优越性。早在20世纪90年代，已有学者提出将指纹图谱技术应用于中药制剂质量的控制。2000年，国家食品药品监督管理局制定并发布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，率先在注射剂质量控制中应用指纹图谱技术，要求中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下，制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱，确保中药注射剂的质量稳定、可控。随着注射液指纹图谱研究的展开，更多其它剂型的中药制剂也相继开展了指纹图谱研究，使中药制剂质量评价上升到了新的台阶。赵陆华等［10］建立了肾宝合剂的高效液相指纹图谱，8个共有峰体现了淫羊藿、补骨脂、蛇床子3种药材的特征，为全面控制肾宝合剂的质量提供了可靠的方法。邓文红等［11］用RP-HPLC法对灵芝原料、原料药、灵芝注射粉针、水针进行分析，确定了12个共有峰，确定了以上4种药剂的指纹图谱，为灵芝及其制剂的质量控制提供更为科学的依据和有效的鉴别方法。随着分析技术的多样化，不同分析技术被应用到中药制剂指纹图谱分析中，为指纹图谱研究带来了新的思路和方法。刘小平等［12，13］分别应用X射线衍射法、红外光谱法对著名方剂六味地黄丸进行了鉴定研究，建立了六味地黄丸的X射线衍射Fourier标准指纹图谱、红外光谱标准指纹图谱。孙国祥等［14］建立了复方甘草片的毛细管电泳指纹图谱，显示了毛细管电泳技术在复杂中药样品的指纹图谱分析中具有独到的专长和优势。随着研究的深入，指纹图谱除在中药制剂的质量控制中发挥举足轻重的作用外，还被赋予更艰巨的任务，在更多的中药研究项目中发挥作用。刘韶等［15］采用指纹图谱为考察手段，选择具有代表性的复方汤剂黄连解毒汤，对传统饮片汤剂与现代颗粒汤剂进行整体质量比较，发现样品之间相似性较好，说明颗粒汤剂代表饮片汤剂是可行的。

　　2.5  中药制剂谱效结合研究中药谱效学是立足在中医药化理论上，借助中药指纹图谱技术，建立指纹图谱中所有的成分与中药质量疗效的内在关系，作为质量控制标准的重要依据。谱效学研究，把中药化学成分与其作用产生的生物效应有机结合起来，使对中药质量的评价更、直观。多维多息谱等理论的提出正是谱效学理论的极致。目前，谱效结合研究在中药制剂中的实践应用刚处于起步阶段，但有关学者进行的探索可给予我们提示和启发。宁黎丽等［16］“吴茱萸汤药效物质基础的方法学研究”，该研究通过对吴茱萸汤进行组方药量变化，在原方基础上按正交实验法组成9个不同配比的处方，同时对其进行高效液相色谱(HPLC)分析和镇痛与止呕两个指标的药理实验，对所得化学数据和药理数据进行逐步回归分析，确定吴茱萸汤的药效物质基础。宋宗华等［17］研究伤寒论名方“苓桂术甘汤”(茯苓,桂枝,白术,甘草)的配伍机制及药效物质基础，采用正交实验设计对方中组成药味进行药味与药量同时加减拆方，选择小鼠常压耐缺氧、对抗氯仿所致小鼠心律失常和利尿3项药理指标对所得16个处方进行药理实验，采用方差分析逐步回归分析(SREG)与典型相关分析(CCOR)将所得药理数据和组方药味及药量相关联，探讨复方苓桂术甘汤的配伍机制；同时对各处方进行HPLC色谱指纹图谱研究，将所得药理数据和各指纹峰的峰面积(即各化合物的含量)相关联，探讨复方苓桂术甘汤的药效物质基础，并确定桂皮酸、甘草酸和去氢土莫酸为质量控制指标。上述研究均是谱效学在中药制剂研究中的有意义的尝试，同时为阐明复方中药的药效学和物质基础提供了科学的思路。

　　2.6  为中药新药研发提供新思路、新模式谱效学发展继而形成了组效学。组效学是指通过药物信息学的方法进行信息的挖掘研究，去除和药效无关的化学成分，找出和药效活性真正相关的药效成分群(药效组分)，这样得出的中药药效组分指纹图谱就可以为建立中药新药创制理论体系提供化学研究、药效研究和信息科学相结合的新的途径和方法。中药指纹图谱包括信息处理、信息获取、信息挖掘3方面的内容。清华大学罗国安教授认为［18］，在中药化学指纹图谱、药效物质成分鉴定和中药药效活性测定的基础上， 充分利用现代化学与生物信息学研究的成果， 开展指纹图谱信息与药效活性信息的相关性研究， 以实现中药化学指纹图谱向中药药效组分指纹图谱的转化，从而建立中药指纹图谱组效学研究体系。针对研究药材、方剂的功效和所涉及的有关靶位或靶点，开展从整体、器官、细胞和分子生物学等不同层次和水平药研究，寻找能够较准确反映方剂药效或功能主治，并具备快速、准确、样品用量小的活性筛选指标，在建立快速中药体内外组分检测方法的基础上，寻找中药的药效组分检测方法的基础上，寻找中药的药效组分群，并建立中药药效指纹图谱，从而形成一套完整的中药药效组分快速筛选体系和方法。

　　3  前景展望

    目前，中药注射剂已全面建立相应的指纹图谱质量控制体系，我们相信在不久的将来，指纹图谱技术将会应用于所有剂型的中药制剂，全面替代目前以单一成分指标控制制剂质量的模式，并在指导制剂工艺的改革、药材—中间体—成品的质量控制、贮藏条件的选择、中药新药研究等方面发挥更大的作用。指纹图谱技术的发展，必定为中药制剂的研究开发带来更美好的明天。

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