中药二步序贯治疗对哮喘小鼠肺组织GATA?3表达及气道炎症的影响

                      作者：刘秀美 曲政海 洪爽 周立

【摘要】  目的 探讨二步序贯即中药人参五味子汤加小青龙汤对哮喘小鼠肺组织GATA?3表达及气道炎症的影响。方法 30只SPF级雌性小鼠被随机分为正常对照组、哮喘模型组、哮喘模型胃饲中药组，每组10只。以卵清蛋白腹腔注射并雾化吸入制备小鼠哮喘模型，并先后予以人参五味子汤加小青龙汤对哮喘小鼠进行治疗。处死后ELISA检测各组小鼠血清中卵蛋白干粉剂(OVA)?IgE水平;肺泡灌洗液(BALF)测定细胞总数及各类炎性细胞数目;HE染色观察肺组织病理变化，免疫组化测定肺组织中GATA?3表达水平。结果 哮喘模型胃饲中药组血清OVA?IgE水平、GATA?3表达水平较哮喘模型组明显降低，较正常对照组升高。哮喘模型胃饲中药组BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞比例、淋巴细胞比例较哮喘模型组降低，较正常对照组升高;而吞噬细胞比例较哮喘模型组升高，较正常对照组降低。结论 人参五味子汤加小青龙汤可能通过影响GATA?3表达进而调节免疫系统，从而控制哮喘小鼠气道炎症，对其治疗起重要作用。

【关键词】  哮喘; 小鼠; GATA?3; 人参五味子汤; 小青龙汤; 喘/治疗; 动物，实验

　　【Abstract】 Objective To study the effect of Xiaoqinglong decoction and Ginseng?Schisandrae decoction on the expression of GATA?3 and airway inflammation in lungs of mice with asthma.Methods Thirty mice were randomly divided into three groups(n=10,in each group):normal control group,model group,Xiaoqinglong decoction and Ginseng?Schisandrae decoction group.The mouse group of asthma were made by the egg albumen sensitization method and treated early with Xiaoqinglong decoction and Ginseng?Schisandrae decoction.OVA?IgE in the serum of mice were detected with enzyme?linked immunosorbent assay (ELISA).The total number of cells in the BALF and the classification of cells were tested.The pathology of lung tissue was examined by HE.GATA?3 in the lung tissue was examined with immunohistochemical method.Results The OVA?IgE and GATA?3 were decreased in the Xiaoqinglong decoction and Ginseng?Schisandrae decoction group compared with the model group and was increased compared with the normal control group.The total cells and the percentage of eosinophils and lymphocytes in BALF in Xiaoqinglong decoction and Ginseng?Schisandrae decoction group were decreased compared with those in model group and increased compared with those in normal control group(all P<0.01).The percentage of phagocyte in BALF in Xiaoqinglong decoction and Ginseng?Schisandrae decoction group was increased compared with those in model group and decreased compared with those in normal control group(P<0.01).Conclusion Xiaoqinglong decoction and Ginseng?Schisandrae decoction may regulate immune system by influencing the expression of GATA?3,which plays an important role in treating asthmatic mice.

　　【Key words】 Asthma; Mice; GATA?3; Ginseng?Schisandrae decoction; Xiaoqinglong decoction; Asthma/treatment; Animal,experiment

　　支气管哮喘是一种慢性变态反应性疾病,目前研究多支持哮喘与Th1和Th2细胞亚群失衡有关，Th2细胞亚群优势应答是支气管哮喘病理形成过程的始动因素和维持因素[1]。近来发现的GATA?3转录因子是T细胞发育中关键的调节因子，可特异性诱导Th2细胞分化。调控Th1/Th2平衡,在支气管哮喘的发病中起重要作用。本文旨在观察人参五味子汤加小青龙汤对哮喘小鼠肺组织GATA?3及气道炎症的影响，以进一步探讨该中药对哮喘免疫调节机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂及材料 卵蛋白干粉剂(OVA)(美国Sigma公司);明矾;IgE?ELISA试剂盒(美国BPB生物制药公司);鼠GATA?3单克隆抗体(北京中杉);人参五味子汤;小青龙汤;空气驱动雾化器(百瑞公司);显微镜;离心机等。

　　1.2 实验动物分组及模型制备 健康雌性昆明系小鼠30只[青岛市实验动物中心，批号：SCXK(鲁)20030010]，4～6周龄，体质量20～30 g。饲养于青岛SPF级实验动物中心，按随机数字实验表法分为三组，正常对照组、哮喘模型组、哮喘模型胃饲中药组各10只。根据[2]，哮喘模型组、哮喘模型胃饲中药组分别于0，14 d行腹腔注射含OVA 100 μg和明矾2 mg混悬液0.3 mL。正常对照组分别于0，14 d腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)0.3 mL。最后1次腹腔注射结束后1周，将哮喘模型组、哮喘模型胃饲中药组小鼠分别放于12 L玻璃雾化箱内,以5% OVA进行雾化吸入激发,每日1次，每次30 min，连续10 d。正常对照组则雾化吸入PBS液，每日1次，每次30 min，连续10 d。

　　1.3 实验方法及给药途径 正常对照组：于最后1次雾化结束后2周行腹腔麻醉处死。哮喘模型组：最后1次激发结束24 h内行腹腔麻醉处死。哮喘模型胃饲中药组：模型建立阶段,据文献[3,4],每日给予小鼠人参五味子汤0.4 mL胃饲(党参8 g，白术6 g，茯苓10 g,炙甘草3 g,麦冬10 g,五味子3 g，所有药物经浸泡、煎熬、过滤及浓缩成100 mL药汁，将浓缩后的药汁装入已消毒的容器中,置于4 ℃冰箱保存，1 mL含0.4 g生药);最后1次激发结束后，每日给予小鼠胃饲小青龙汤0.4 mL(麻黄、白芍、干姜各9 g，细辛3 g，甘草4 g，半夏8 g，五味子3 g，桂枝6 g，做法同上，1 mL含0.33 g生药)，连续2周结束后于24 h内行腹腔麻醉处死。

　　1.4 取材 予10%水合氯醛0.3 mL腹腔注射，麻醉后摘眼球取血约1.5 mL，2 000 r/min离心15 min，留取上清，保存于-80 ℃，待测OVA?IgE;打开胸腔，结扎右肺，行气管插管，PBS 0.4 mL行肺泡灌洗，回收率约70%～80%;并取少许肺组织加入10%甲醛固定液固定约24 h,脱水,石蜡包埋,制备厚4 μm的标准切片。

　　1.5 测定肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数及分类 BALF离心去除上清，加入PBS液1 mL，吹打均匀，取约10 μL置入细胞计数板，计数;取少许推片，瑞氏染色，镜下分类淋巴细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞比例。

　　1.6 肺组织HE染色及GATA?3测定 行HE法观察肺组织普通病改变;行免疫组织化学法监测GATA?3在肺组织中的表达，每张切片随机选取4个高倍镜视野，分别测定GATA?3阳性细胞个数，以此代表GATA?3在各组肺组织中的相对表达量。

　　1.7 OVA?IgE测定 严格按ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪450 nm比色，测量样本及标准品A值。标本 OVA?IgE水平。

　　1.8 统计学分析 实验数据以±s表示,采用SPSS 17.0统计软件进行分析。组间均数差异的比较用单因素方差分析检验。

　　2 结果

　　2.1 体征变化 5% OVA雾化激发阶段，哮喘模型组小鼠出现烦躁不安，呼吸急促，腹肌抽搐，四肢挠抓，有的尿便失禁;哮喘模型胃饲中药组表现较轻;正常对照组无此反应。

　　2.2 BALF中细胞总数及细胞分类 见表1。表1 各组小鼠BALF中细胞总数及细胞分类比较注：实验过程中，每组脱落2只，故本结果按8只。

　　由表1可见，哮喘模型胃饲中药组白细胞总数、嗜酸性粒细胞比例及淋巴细胞比例较正常对照组均升高，较哮喘模型组均降低(P<0.01);哮喘模型胃饲中药组吞噬细胞比例较正常对照组降低，较哮喘模型组升高(P<0.01)。

　　2.3 各组小鼠血清中IgE及肺组织中GATA?3的表达水平 见表2。表2 各组小鼠血清中IgE及肺组织中GATA?3的表达水平比较注：实验过程中，每组脱落2只，故本结果按8只计算。

　　由表2看出，哮喘模型组和哮喘模型胃饲中药组IgE，GATA?3S水平高于正常对照组，且哮喘模型组高于哮喘模型胃饲中药组(均P<0.01)。

　　2.4 肺组织HE染色结果 正常对照组肺组织无炎性反应，气道黏膜完整,上皮细胞无明显增生,管壁无增厚,无明显炎症细胞浸润;哮喘模型组小鼠肺组织黏膜上皮细胞增生或局部脱落,黏液分泌增多，支气管周围有大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润;哮喘模型胃饲中药组肺组织炎症较轻，黏膜上皮无脱落，增生不明显，有少许黏液分泌，支气管周围有少量炎症细胞。

　　3 讨论

　　哮喘是一种慢性气道非特异性炎症反应，大量研究表明，哮喘与Th1和Th2亚群失衡有关，Th2细胞产生IL?4，IL?5，IL?13等细胞因子，其中IL?5和IL?13可促进嗜酸性细胞分化﹑成熟﹑内皮黏附﹑激活和脱颗粒;IL?4促进B淋巴细胞转化，促进IgE生成，促进肥大细胞成熟、分化，调节细胞黏附分子生成，从而致小气道慢性炎症[2?5]。GATA?3是转录因子GATA家族成员之一，是一种锌指蛋白，为Th2细胞特异性转录因子。静止期CD4+T细胞表达低水平的GATA?3 mRNA,但GATA?3的表达在Th2细胞分化过程中迅速上调,而在Th1细胞分化过程中下调。发育中的Th1如过度表达GATA?3能导致IL?12受体β2亚单位表达受阻,并伴有干扰素产生障碍。研究证实,GATA?3控制Th2活性，是通过诱导Th2细胞因子基因表达,并且诱导Th0细胞偏向Th2功能分化[6]。IL?4,IL?5,IL?13和γ干扰素等细胞因子的基因启动子上含有GATA?3结合位点,提示GATA?3对于这些细胞因子基因表达可能起一定作用,其中Th2类细胞因子IL?5和IL?13高度依赖GATA?3,GATA?3表达可诱导IL?5和IL?13启动子活性增加10倍,而IL?4启动子活性增加2倍且GATA?3缺陷的Th2细胞IL?10也分泌减少[7]。同时细胞因子可通过反馈环诱导GATA?3的表达。由此提示哮喘可能与GATA?3过度表达有关。

　　该实验应用OVA致敏小鼠制作哮喘模型，哮喘模型组和正常对照组比较，小鼠OVA雾化激发阶段出现烦躁不安，呼吸急促，有的出现尿便失禁，BALF中细胞数、肺病理变化差异均有统计学意义，OVA?IgE明显升高(P<0.01)，GATA?3表达增加(P<0.01)，提示Th2细胞优势，显示模型建造成功。

　　从中医角度讲，哮喘是外因作用于内因的结果,痰瘀内伏为其夙根,虚则责之于肺、脾、肾三脏之亏,强调哮喘补肺、脾、肾之重要。同时指出哮喘要分期分症，小儿哮喘有发作期与缓解期之分,也有寒热虚实之分。发作期应宣肺化痰,治疗予定喘化痰煎;缓解期则补肺益肾,治疗予补肺益肾汤。

　　人参五味子汤出自清代《幼幼集成》,由人参、白术、茯苓、甘草、麦冬、五味子组成,内含四君子汤、生脉散二方,具有益气健脾、固卫养肺之效,主治“久嗽脾虚,中气怯弱,面白唇白……”“咳而久不止,并无他证……”等病证。方中人参大补元气,“主补五藏”,以复气虚之本;配茯苓、白术、甘草补中健脾,淡湿助运,补中宫土气;配五味子收敛肺气,以固气泄之标;再用麦冬甘寒清润以清肺气，因此，人参五味子汤有补肺益肾之功效。据药理研究,人参五味子汤方中诸药皆具有调节免疫,增强免疫功能的作用[8]，据上述理论，本实验于小鼠哮喘诱导阶段即相当于哮喘缓解期予人参五味子汤治疗，从而起补肺益肾，调节哮喘小鼠免疫力的作用。

　　而小青龙汤出自张仲景的《伤寒论》,由麻黄、桂枝、干姜、细辛、半夏、白芍、五味子、甘草组成[9,10]。其中小青龙汤中麻黄、桂枝解痉平喘宣肺气，细辛温肺化饮，兼助麻黄，桂枝宣肺气，配伍五味子敛肺气，白芍养血，半夏去痰和胃而散结，而起到宜肺祛风之效。中医学认为小儿哮喘每因反复感受时邪，触动伏痰，痰阻气道所致。当哮喘发作时，痰随气升，气困痰阻，相互搏结，阻塞气道，肺管因而狭窄，气机升降不利而气息喘促，因而小青龙汤适用于哮喘急性发作期，以疏利气机。据研究，小青龙汤还可提高肺组织糖皮质激素及β受体数目，介导肺NGF生成，降低嗜酸性粒细胞及IL?5水平等作用。据上述理论，本实验于小鼠哮喘激发阶段及相当于人哮喘急性发作阶段予小青龙汤治疗，从而起祛痰平喘的作用。

　　据上述两种中药的作用机制，该实验于哮喘小鼠致敏阶段予人参五味子汤胃饲以起益气健脾、固卫养肺之效，即调节机体免疫力;于哮喘小鼠激发阶段予小青龙汤以起发汗解表、宣肺平喘之功，从而达到标本兼治的效果。该实验结果显示予中药治疗组，小鼠激发阶段症状较轻，BALF中炎性细胞数目及IgE水平较哮喘组明显降低，肺组织炎症较轻，GATA?3水平较哮喘组显著降低。因此，二步序贯疗法即人参五味子汤加小青龙汤可明显下调哮喘小鼠肺组织GATA?3的表达，并明显降低哮喘小鼠肺组织的炎症，对哮喘的中药序贯治疗提供理论基础。

【】
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