三聚氰胺诱发SD大鼠尿结石初步观察

                       作者：邹移海,张薇,张钟广,符路娣,郭学军

             黄武当,伍军军 黄海定,陈剑波,谢玲玲,何国振,陈小霞,桑传兰

【摘要】  【目的】 观察三聚氰胺连续给药20d诱发SD大鼠尿结石的情况。【方法】 60日龄SPF级SD大鼠190只共分为6组，5组给药组每组各34只，分别给予三聚氰胺2?5、2?0、1?5、1?0、0?5g/kg连续灌胃；空白对照组20只，每天灌胃10g/L甲基纤维素溶液。采用肉眼和体视显微镜观察大鼠肾脏、输尿管和膀胱形态改变，比较各组肾脏、膀胱的质量和脏器指数，观察大鼠血肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、钙、磷、镁的含量变化。【结果】 给药10d各组大鼠膀胱结石发生率为9%（4/47），给药20d各组大鼠膀胱结石发生率为37%（11/30），输尿管结石发生率为93%（28/30）。给药10d和20d各组大鼠肾脏均肿大呈灰黄色，肾内均出现条索状黄色沉淀物，部分肾脏有点状或片状出血灶。给药20d各组肾内黄色沉淀物开始融合成片状或颗粒状，并在皮质和髓质之间形成黄色弧形光环。给药10d和20d各组肾脏质量和脏器指数均显著性升高，给药20d血CREA、BUN、磷、镁含量升高（Ｐ＜０?０１）。【结论】使用0?5~2?5g/kg三聚氰胺连续给药20d，可诱发部分SD大鼠产生膀胱结石和输尿管结石，肾脏出现黄色片状或颗粒状沉淀物。

【关键词】  三聚氰胺/毒性；结石；疾病模型，动物；大鼠

2008年9月，我国爆发三鹿牌婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用受污染奶粉的婴幼儿产生尿结石，其原因是奶粉中掺杂了三聚氰胺。据卫生部通报，截至2008年11月27日8时，全国因三鹿牌婴幼儿奶粉事件累计筛查婴幼儿2 238万余人次，泌尿系统出现异常的患儿共29万余人，累计住院的共5万余人，目前仍在住院的有800余人。本实验采用三聚氰胺连续灌胃给药方法，建立SD大鼠尿结石动物模型，初步观察结果如下。

　　1材料与方法

    1?1动物60日龄SPF级SD大鼠190只，雌雄各半，体质量（213±14）g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：粤监证字2008A002。

    1?2药物三聚氰胺由河南骏化股份有限公司生产，经广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心食品实验室检测，证实送检样品为三聚氰胺,纯度88%,检测报告证书编号：4400/0805004。将三聚氰胺用蒸馏水配制成250g/L的浓度，并加入10g/L的甲基纤维素。每次给药前将药物搅拌均匀后吸取。配制10g/L甲基纤维素蒸馏水溶液供空白对照组使用。

    1?3分组与造模按随机区组法将大鼠分成6组,5个给药组每组各34只，空白对照组20只，各组大鼠均为雌雄各半。给药组分别按2?5、2?0、1?5、1?0、0?5g/kg剂量三聚氰胺连续灌胃，空白对照组每天灌胃10g/L 甲基纤维素溶液2mL/只。

    1?4实验环境与饮食动物实验在广州中医药大学实验动物中心屏障环境动物实验设施中进行（合格证号：粤监证字2008C063），实验期间动物自由采食和饮水。

    1?5观察指标每天观察记录大鼠的一般情况，如毛发、饮食、活动、精神状态和死亡情况。在连续给药第10天和第20天，给药每组各取10只大鼠，第20天取空白对照组10只大鼠，乙醚麻醉后切开颈部血管放血，解剖观察和取材，称量肾脏和膀胱质量，脏器指数。取双肾做冠状剖面，剖开膀胱，使用日本Olympus体视显微镜系统（型号：SZ61），对肾脏、输尿管、膀胱进行观察，拍摄照片直接在电脑中显示和储存。给药第20天各组大鼠禁食12h，乙醚麻醉后实施眼眶静脉丛采血，检测肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、钙、磷、镁含量。

    1?6统计学方法采用SPSS　10?0统计软件进行统计学处理。

　　2结果

    2?1大鼠死亡及一般情况170只给药大鼠在第6~9天死亡61只（给药2?5、2?0、1?5、1?0g/kg组分别死亡27、24、8、2只），给药第10天取材47只（给药2?5g/kg组只剩7只，2?0、1?5、1?0、0?5g/kg组各10只）后，剩余62只（给药2?5、2?0g/kg组全部死亡）。给药第11~19天大鼠死亡5只（给药1?5g/kg组3只，0?5g/kg组 2只），第20天给药1?5、1?0g、0?5g/kg组共取材30只，余下27只（给药1?5、1?0、0?5g/kg组分别为3、12、12只）继续给药观察。另外空白对照组大鼠20只，在实验第20天取材10只，留10只作进一步观察。给药大鼠的症状表现为活动度差、进食少、毛松和竖毛，部分大鼠出现多尿和尿血，个别动物死亡前出现抽搐、单侧或双侧后肢瘫痪。

    2?2各组大鼠体质量，左肾、右肾质量及脏器指数比较6组共190只SPF级SD大鼠平均体质量（213±14）g，各组体质量比较无显著性差异（P＞0?05）。表1、表2结果表明，给药10d及20d 的各组大鼠左肾和右肾质量明显增加，是空白对照组肾脏质量的2~3倍，差异均有显著性意义（P＜0?01），其中给药10d 0?5g/kg组左肾和右肾质量增加最为明显，与给药10d的2?5、2?0、1?5g/kg组比较，差异有非常显著性意义（P＜0?01）。给药20d的0?5g/kg组左肾和右肾质量虽然也明显增加,但与1?5、1?0g/kg组比较差异无显著性意义（P＞0?05）。给药10d及20d 的各组大鼠左肾和右肾脏器指数均高于空白对照组，差异具有非常显著性意义（P＜0?01），结果与肾脏质量增加的改变一致。给药10d的0?5g/kg组左肾和右肾脏器指数的数值最高，与给药10d 1?5、1?0g/kg组比较，差异均有非常显著性意义（P＜0?01），与给药0?5g/kg组肾脏质量改变的结果比较接近。给药10d、20d相同组别左肾和右肾质量及脏器指数的比较，只有左肾和右肾1?0g/kg组脏器指数的比较差异有显著性意义（P＜0?01）。

    2?3各组大鼠膀胱质量及脏器指数比较表3结果显示，给药10d的2?5、2?0、1?5、1?0、0?5g/kg组，给药20d的1?5、1?0、0?5g/kg组膀胱质量分别与空白对照组比较，差异均有非常显著性意义（P＜0?01）。给药10d 2?5、2?0、0?5g/kg组，给药20d 1?5、1?0、0?5g/kg组膀胱脏器指数分别与空白对照组比较，差异均有非常显著性意义（P＜0?01）。给药20d 1?5、1?0、0?5g/kg组膀胱脏器指数分别与给药10d相同组别比较，差异均有非常显著性意义（P＜0?01）。

    2?4连续给药20d大鼠CREA、BUN、UA、钙、磷、镁含量比较表4、表5结果显示，连续给药20d大鼠血清CREA、BUN、磷、镁含量显著升高，与空白对照组比较，差异有非常显著性意义（P＜0?01）。1?0、0?5g/kg组的大鼠血清UA含量降低，与空白对照组比较，差异有非常显著性意义（P＜0?01）。给药1?5、1?0g/kg组大鼠的血清钙含量与空白对照组比较，差异有显著性意义（P＜0?05或P＜0?01）。表1各组大鼠左肾质量及脏器指数比较表2各组大鼠右肾质量及脏器指数比较 表3各组大鼠膀胱质量及脏器指数比较表4各组大鼠血清CREA、BUN、UA含量比较表5各组大鼠血清钙、磷和镁含量比较

    2?5肾脏、输尿管和膀胱体视显微镜观察结果结果可见，空白对照组大鼠肾脏表面鲜红色,肾皮质剖面呈红褐色,肾髓质呈浅红色,肾门处可见肾乳头或肾盏、肾盂（图1-a，c）。给药后，各组大鼠肾脏明显肿大，外观呈灰黄色，我们称之为“灰黄肾”，肾内布满淡黄色斑点（图1-b）。给药10d的2?5、2?0、1?5、1?0、0?5g/kg组肾脏剖面于体视镜下观察，均出现沿髓放射状排列的黄色条索状沉淀物，沉积在髓质及靠近髓质的皮质，部分肾皮、髓质交界处有点状或片状充血出血灶（图1-d,e,f,g,h）。给药20d的1?5、1?0、0?5g/kg组肾脏剖面发现，黄色条索状沉淀物明显增多，分布在肾皮质和髓质，部分沉淀物已聚集成片状或颗粒状，并在肾皮质与髓质之间积聚成黄色弧形光环，少数肾皮、髓质交界处有点状或片状充血出血灶（图1-i,j,k），肾乳头和肾实质内形成黄色细小结石（图1-l,m,n）。空白对照组输尿管壁呈粉红色，腔内无结石存在（图2-a）。给药20d的1?5、1?0、0?5g/kg组输尿管均发现结石，其发生率为93%（28/30，图2-b，c，d），另外2例输尿管出现黄色沉淀物。空白对照组膀胱剖面见黏膜呈淡红色，无结石存在（图3-a）。给药10d的2?5、2?0、1?5、1?0、0?5g/kg组膀胱结石发生率为9%（4/47），2?5、2?0g/kg组各占2例，结石单发或多发，呈黄白色结晶状（图3-b,c,d,e），膀胱出现黄色沉淀物几率为53%（25/47），部分膀胱有充血表现。给药20d的1?5、1?0、0?5g/kg组膀胱结石发生率为37%（11/30），其中1?5g/kg组2例（图3-f），形成的结石颗粒较小，1?0g/kg组3例（图3-g,h,i），0?5g/kg组6例（图3-j,k,l,m,n,o）；结石有白色和黄色两种，其中最典型1例的结石数量多达数10粒，分别呈黄色和白色（图3-j），膀胱发现黄色沉淀物的几率是47%（14/30），部分膀胱有充血表现。（注：图１、２、３彩图见第１０１页）3讨论尿结石是泌尿外科的常见多发病,进行尿结石防治的基础研究离不开动物实验和尿结石动物模型，尿结石动物模型的造模方法已有：草酸钙结石法、磷酸钙结石法、磷酸镁结石法、尿酸结石法、胱氨酸结石法、对苯二甲酸结石法［1］，以及溶脲脲原体感染法［2］和植入异物法等。使用频率最高的是草酸钙结石模型［3］，该模型常以服用乙二醇和氯化胺诱发，使用的实验动物多为大鼠。受三鹿牌婴幼儿奶粉事件导致婴幼儿发生尿结石的启发，我们设计了本实验，拟通过研制三聚氰胺诱发大鼠尿结石，为防治上述婴幼儿尿结石疾病提供动物模型。三聚氰胺（Melamine）是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，为纯白色单斜棱晶体，无味，呈弱碱性，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。溶于热水，微溶于冷水和热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业，常用于制造装饰面板、涂料、防火材料、塑料制品、PVC管材和型材等。三聚氰胺甲醛树酯与其他原料混配，还可以生产出织物整理剂、皮革鞣润剂、上光剂和抗水剂、橡胶粘合剂、助燃剂、高效水泥减水剂、钢材淡化剂等［4-5］。动物长期服食三聚氰胺可以诱发泌尿系统肿瘤和结石，有报道在饲料中加入30g/L的三聚氰胺喂饲F344/DuCrj大鼠36周，膀胱癌或乳头状瘤的发生率高达55%、90%［6］。有研究者观察了胸腺嘧啶和三聚氰胺对膀胱肿瘤发生率的影响，将3０mg/L胸腺嘧啶和10g/L三聚氰胺加入饲料为1组，30g/L三聚氰胺加入饲料为另1组，喂饲6周龄的F344大鼠36周，再正常喂养4周，2组的膀胱结石发生率为70%和100%，膀胱癌发生率分别为5%和79%［7］，结果提示胸腺嘧啶有降低膀胱癌发生率的作用。三聚氰胺诱发的尿结石成分主要是三聚氰胺和尿酸［８］。三聚氰胺的毒性研究方面，目前认为三聚氰胺在机体内不会发生任何类型的代谢变化，单胃动物以原体形式排出三聚氰胺，受害动物出现肾远曲小管损伤并在远曲小管或者集合管呈现条纹状的特异性结晶，有报道在饲料中按照2?4g/kg添加三聚氰胺，连续30d饲喂猫，肾脏病检可见，肾小管中出现晶体，肾脏可见淋巴细胞浸润［９］。三聚氰胺中毒的机制是肾衰，但肾衰与肾脏结晶之间的关系仍不清楚。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第３卷指出，长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。三聚氰胺对不同动物种属毒性具有选择性，大鼠经口半数致死量（LD50）为3?16g/kg［8］。小鼠经口给药的全部不死最大剂量为5?00g/kg［9］。在上述资料的前提下，我们开展了预实验，将17只70~80日龄SPF级SD大鼠［平均体质量(269 ±41)g］随机分为7g/kg、5g/kg、3g/kg、1?0g/kg三聚氰胺连续灌胃，三聚氰胺是河南骏化股份有限公司生产的原料。结果三聚氰胺7、5、3g/kg连续给药的大鼠全部死亡（除3g/kg剂量组1只动物在第10天死亡外，各组动物均在给药第2~7天死亡，且剂量越大死亡时间越短）。1?0g/kg组动物在连续给药20d后仍然全部存活。据此我们将正式实验的三聚氰胺连续给药剂量下调到2?5g/kg~0?5g/kg之间。预实验各组大鼠肾脏均明显肿大、充血，肾脏剖面在体视显微镜下可见，肾脏布满黄色条索状沉淀物，沿髓放线呈放射状排列。有2只大鼠发现黄色膀胱结石。将肾脏布满黄色条索状沉淀物的4个大鼠肾脏拍摄X线片，未见阳性结石阴影。预实验为药物配制和解剖镜检提供了依据。研制三聚氰胺尿结石动物模型应重点考虑给药剂量、成模时间和药物毒性等问题。正式实验中，三聚氰胺按2?5、2?0g/kg连续给药大鼠均在给药后10d内全部死亡，1?5g/kg连续给药大鼠在10d内死亡超过20%（7/34），提示1?5g/kg~2?5g/kg各组动物给药剂量太大，可能不适合造模。1?0g/kg给药剂量动物在10d内死亡2只，0?5g/kg在10~20d死亡2只。依据本实验结果，1?0g/kg和0?5g/kg给药剂量较适合造模。与大鼠经口单次给药LD50为3?16g/kg［8］的结果比较，连续给药的毒性增加，导致动物死亡的剂量降低。结果表明，给药10d大鼠膀胱结石发生率为9%，成模率较低；各剂量组大鼠肾脏均出现条索状黄色沉淀物。连续给药20d，1?5、1?0、0?5g/kg组大鼠膀胱结石发生率为37%，输尿管结石发生率达到93%，成模率较高；肾脏内黄色沉淀物融合成片状或颗粒状，个别已在肾乳头和肾实质形成细小结石，解剖肾脏时刀片有接触到沙子的感觉，表明肾脏已经开始形成结石雏形。因此造模20d以上可以导致动物出现尿结石。本研究通过对肾脏和膀胱的大体解剖和体视显微镜观察，比较脏器质量和脏器指数，检测血生化指标，观察三聚氰胺连续给药产生的毒性。结果表明，给药动物肾脏明显肿大，颜色变灰黄色，左、右肾脏质量和脏器指数均是正常肾脏的2~3倍，膀胱质量和脏器指数也比正常动物高。体视镜下观察，部分动物肾皮、髓质交界处出现点状或片状充血出血灶。连续给药1?5、1?0、0?5g/kg三聚氰胺20d，大鼠血CREA、BUN含量均高于空白对照组，说明三聚氰胺已使大鼠肾脏出现一定程度的损害，结合体视显微镜所见的尿结石情况，推测肾脏受损原因可能与三聚氰胺在肾脏的沉积及尿结石导致尿路堵塞等因素有关。结果提示三聚氰胺连续给药对肾脏存在一定的毒性,故应考虑使用小于0?5g/kg剂量造模，以降低三聚氰胺的毒性。急性肾功能衰竭可出现血钙、磷、镁数值改变，本研究结果钙、磷、镁均升高，可能与肾小球排泄功能下降有关。三聚氰胺1?0、0?5g/kg连续给药组的尿酸含量低于空白对照组，其原因有待进一步观察。由于三聚氰胺溶于甲醛，预实验中发现，经甲醛固定后，肾脏内的黄色沉淀物似有溶解现象，故未能完成肾脏和膀胱的病理切片观察。

【参考文献】
  ［1］方厚华.医学实验模型动物［M］.北京：军事医学出版社，2002：144.

［2］王勇，韩晓冬，侯亚义.溶脲脲原体感染导致大鼠泌尿道形成结石［J］.医学研究生学报，2004，17（2）：120.

［3］李祥平，欧阳健明.草酸钙结石的动物模型研究进展［J］.病理生理杂志，2003，19（5）：717.

［4］王娟娟，陈凯，朱小蕾.“宠物毒粮”中的假冒蛋白质——三聚氰胺［J］.化学，2008，29（8）：4.

［5］冯建民.中国三聚氰胺生产应用现状及产业技术分析［J］.化工文摘，2006，29（5）：11.

［6］Ogasawara H,Imaida K,Ishiwata H,et al.Urinary bladder carcinogenesis induced by melamine in F344 male rats:correlation between carcinogenicity and urolith［J］.Carcinogenesis,1995，16（11）：2773.

［7］Okumura M,Hasegawa R,Shirai T,et al.Relationship between calculus formation and carcinogenesis in the urinary bladder of rats administered the non-genotoxic agents thymine or melamine［J］.Carcinogenesis,1992，13（6）：1043.

［８］邵静君，温家琪，徐世文.三聚氰胺毒研究进展［J］.畜牧兽医，2007（12）：52.

［９］林祥梅,王建峰,贾广乐,等.三聚氰胺的毒性研究［J］.毒理学杂志，2008，22（3）：216.