针药合用刺激嗅觉系统对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及大脑边缘叶自由基系统的影响
作者：牛文民，刘智斌，杨晓航，牛晓梅，王渊
【摘要】 【目的】探讨针药合用刺激嗅觉系统对血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆功能及大脑边缘叶自由基系统的影响。【方法】选用成年SD雄性大鼠48只，随机分为正常对照组、VD模型组、嗅三针组(针刺两侧迎香及印堂穴)、丁香酚刺激组、针药合用1组(先复制VD模型，然后损毁双侧嗅球，再行嗅三针和丁香酚刺激)及针药合用2组(仅复制VD模型，再行嗅三针和丁香酚刺激)，每组8只。测试各组大鼠水迷宫学习记忆能力并测定大脑边缘叶丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH?Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。【结果】学习记忆能力检测结果显示，大鼠6 d平均逃避潜伏期和平均游泳路程比较，VD模型组显著长于正常对照组(P<0?01);嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用2组显著短于VD模型组(P<0?01);针药合用2组短于嗅三针组、丁香酚刺激组(P<0?05)。嗅三针组与丁香酚刺激组比较、VD模型组与针药合用1组比较，差异均无显著性意义(P>0?05)。大脑边缘叶自由基系统检测结果显示，与正常对照组比较，VD模型组MDA含量显著增高(P<0?01)，而GSH?Px和SOD活性显著降低(P<0?01);与VD模型组比较，嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用2组MDA含量显著降低(P<0?01)，而GSH?Px和SOD活性显著增高(P<0?01);针药合用2组与嗅三针组、丁香酚刺激组比较，MDA含量降低(P<0?05)，而GSH?Px和SOD活性增高(P<0?05);嗅三针组与丁香酚刺激组比较、VD模型组与针药合用1组比较，MDA含量及GSH?Px、SOD活性差异均无显著性意义(P>0?05)。【结论】嗅三针和丁香酚均能够显著增强VD大鼠学习记忆功能，降低大脑边缘叶MDA的含量，提高大脑边缘叶GSH?Px和SOD的活性，针药合用具有一定协同作用，其效应的发挥依赖于嗅觉传导通路的完整性。
【关键词】 血管性痴呆/针灸疗法;血管性痴呆/中药疗法;自由基;疾病模型，动物;大鼠;穴，迎香;穴，印堂
血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由脑血管疾病因素导致脑组织损害而引起的痴呆综合征。研究表明[1]，自由基过氧化损伤是VD的主要病理机制之一。依据多年来治疗VD的经验[2-4]，本研究选择血管性痴呆大鼠作为对象，探讨针药合用刺激嗅觉系统对VD大鼠学习记忆能力及大脑边缘叶自由基系统的影响。现将结果报道如下。
1材料与方法
1?1动物及分组成年Sprague Dawley雄性大鼠48只，体质量(300±10)g，由第四军医大学实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK(陕)2002?006。实验动物随机分为正常对照组，VD模型组，嗅三针组，丁香酚刺激组，针药合用1、2组，每组8只。
1?2主要试剂与仪器丁香酚试剂购自江西樟树市本草天然药用油厂，纯度99%;丙二醛(MDA)含量测定，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH?Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究院;SDQ?30双极射频电凝器(上海手术器械厂出品);Morris 水迷宫实验系统(北京太极有限公司出品);722型光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂出品);G6805型电针仪(上海医疗仪器厂出品)。
1?3模型复制
1?3?1VD大鼠模型复制按照经典的四血管阻断(4?vessel occlusion,4?VO)方法复制血管性痴呆模型[5]。用100 mg/L 水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，常规无菌操作。颈部背侧后正中切口，暴露第一颈椎横突孔，电凝烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞。24 h后，颈部腹侧前正中切口，分离双侧颈总动脉，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5 min, 共夹闭3次，每次间隔1 h。手术部位施以适量青霉素抗感染，仔细缝合，常规饲养。
1?3?2VD损毁嗅球大鼠模型复制参照陈志蓉[6]报道的损毁大鼠嗅球的方法，将VD造模成功的大鼠用水合氯醛麻醉后，固定在立体定位仪上。在大鼠颅顶正中切开皮肤，小范围分离暴露前囟。在大鼠颅顶正中线位于前囟前面5 mm两侧旁开2 mm处，分别钻两个直径为1 mm的小孔，电凝损毁双侧嗅球。
针药合用1组大鼠先复制VD模型，然后再损毁双侧嗅球。嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用2组大鼠仅复制VD模型。
1?4治疗方法实验时间为45 d。
1?4?1嗅三针组嗅三针穴定位：两侧迎香及印堂穴。依据《实验针灸学》动物选穴标准[7]，迎香穴：大鼠鼻孔外侧上端，有毛与无毛交界处;印堂穴：大鼠两眼眶上缘中点连线与正中线交点。操作：选用华佗牌不锈钢针，迎香穴向内上方斜刺0?3 cm，印堂穴向鼻根部平刺0?3 cm;电针仪刺激参数：疏密波，频率80～100 Hz，刺激强度以保持针刺局部轻微抖动为度(电流强度1～3 mA，电压1～3 V)。留针时间为10 min，持续电刺激，每日1次。5 d为1个疗程，休息2 d，共治疗6个疗程。
1?4?2丁香酚刺激组制作1个仅留有2个小通气孔的实验盒，在实验盒底部铺一薄层药棉，将丁香酚溶剂均匀地喷洒在药棉上，在其上放置一个金属网架。待药味充分弥散在整个实验盒时，将实验动物放在金属网架上，然后加盖封闭。10 min后，将实验动物取出。每天1次，5 d为1个疗程，休息2 d，共治疗6个疗程。
1?4?3针药合用1、2组先行嗅三针刺激再行丁香酚刺激。
1?4?4正常对照组及VD模型组每天1次采取与以上3组相同的捉拿固定，但不施加任何干预措施。
1?5检测指标
1?5?1Morris 水迷宫定位航行试验[8]结束后，开始水迷宫测试。水迷宫内水深41 cm，水温22℃～26℃。在水池壁标明4个入水点，由此将水池等分为4个象限，任选一象限正中放置平台，没于水下1 cm，水面覆盖塑料泡沫。将受试大鼠按顺时针方向依次由E、S、W、N 4个入水点顺序面向池壁放入水中。记录2 min内寻找平台的时间(逃避潜伏期)。如果大鼠在2 min内找到平台，记录其实际逃避潜伏期及游泳路程;如果大鼠在2 min内未找到平台，由测试者将其引上平台并停留10 s, 逃避潜伏期记录为2 min。历时6 d,每天1次。用6 d找到平台的平均逃避潜伏期和平均游泳路程评价动物的学习记忆能力。
1?5?2大脑边缘叶自由基系统测定大鼠断头后快速取出全脑，置于冰盘上分离大脑边缘叶皮质，称质量后加入预冷生理盐水，制成100 g/L的脑匀浆，4℃离心(3 000 r/min×20 min),取上清液置于-80℃冰箱内待检。大脑边缘叶MDA含量测定采用硫代巴比妥酸钠(TBA)比色分析法，GSH?Px活性测定采用二硫代二硝基甲苯酸法(DTNB)，SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法。
1?6统计学方法采用SPSS 12?0软件进行统计处理。
2结果
2?1各组大鼠水迷宫学习记忆能力测试结果比较表1结果显示，大鼠6 d平均逃避潜伏期和平均游泳路程比较，VD模型组显著长于正常对照组(P<0?01);嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用2组均显著短于VD模型组(P<0?01);针药合用2组短于嗅三针组和丁香酚刺激组(P<0?05);嗅三针组与丁香酚刺激组比较、VD模型组与针药合用1组比较，差异均无显著性意义(P>0?05)。表1各组大鼠水迷宫学习记忆能力测试结果比较
2?2各组大鼠大脑边缘叶MDA含量及GSH?Px、SOD活性的比较表2结果显示，与正常对照组比较，VD模型组MDA含量显著增高(P<0?01)，GSH?Px和SOD活性显著降低(P<0?01);与VD模型组比较，嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用2组MDA含量显著降低(P<0?01)，而GSH?Px和SOD活性显著增高(P<0?01);针药合用2组与嗅三针组、丁香酚刺激组比较，MDA含量显著降低(P<0?05)，GSH?Px和SOD活性显著增高(P<0?05);嗅三针组与丁香酚刺激组比较、VD模型组与针药合用1组比较，MDA含量及GSH?Px、SOD活性差异无显著性意义(均P>0?05)。表2各组大鼠大脑边缘叶MDA含量及GSH?Px、SOD活性的比
3讨论
血管性痴呆属于中医“善忘”、“呆病”、“痴证”等范畴。依据医学理论，VD是由于心脑血管病变，因缺血性或出血性脑组织损害所导致的认知功能障碍，是老年痴呆的常见类型。现有的研究结果表明[9-10]，自由基是VD脑缺血后神经细胞损伤的主要因素。自由基对学习记忆有明显的损伤作用，其对智力的损害主要表现为对细胞膜上不饱和脂肪酸的破坏和过氧化以及MDA的产生。MDA是一种大分子交联剂，它能交联蛋白质和核酸，直接影响生物信息的传递、转录和复制，表现为记忆及智力下降。SOD和 GSH?Px均为机体内重要的抗氧化金属酶类，它们作为机体内在抗氧化体系，能够直接清除自由基，免除其过氧化损伤。
本研究结果显示，嗅三针和丁香酚均能够显著增强VD模型大鼠学习记忆能力，并能提高VD模型大鼠大脑边缘叶SOD和 GSH?Px活性，同时降低MDA的含量。然而，对于VD损毁嗅球模型大鼠，嗅三针和丁香酚均未能增强其学习记忆能力，也未明显影响大脑边缘叶SOD、GSH?Px活性及MDA的含量。这表明嗅三针和丁香酚对于VD大鼠的疗效是通过嗅觉传导路对中枢神经系统产生作用的，与前期的研究结果相一致[2]。本研究证实了嗅三针和丁香酚均对VD具有确切的治疗作用，其作用机理与调节大脑边缘叶自由基系统密切相关，针药合用具有一定协同作用，其疗效的发挥有赖于嗅觉传导路的完整性。
【】
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