稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定

                       作者：宋娟 张任飞 张彬 蒋碧

【摘要】  目的：建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型。方法：将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞，使核仁素在细胞内表达，用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株；用双酶切、DNA测序鉴定质粒，用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达。结果：经G418反复筛选的H9C2细胞株中，核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高。结论：用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞，经筛选后可稳定表达核仁素。

【关键词】  核仁素；H9C2细胞；基因转染

    Abstract  Objective:To establish H9C2 cell line that can stably express the nucleolin,which can provide a cell line with which we can analyze the function of nucleolin in apoptosis of cardiomyocytes.Methods:The pCMV-Tag2B-Nuc plasmid was transfected into H9C2 cells with lipofectin,the stable transfectants screened by G418 and the expression of nucleolin was identified and analyzed by RT-PCR and Western blot.The pCMV-Tag2B-Nuc plasmid was confirmed by double-enzyme digestion and sequencing.Results:After G418 screening, compared with the control group,the mRNA and protein of nucleolin in transfected cell line were highly expressed, as demonstrated by the RT-PCR and Western blot analysis.Conclusion:The rat H9C2 cell line stably expressing nucleolin was successfully constructed.

    Key words  Nucleolin; H9C2 cell line; Gene transfection

    近年来的研究表明，越来越多的心血管疾病发生与细胞增殖和凋亡有关。细胞凋亡的发生机制十分复杂，至今仍未完全阐明。核仁素（又称C23）是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质，具有多种生物学功能，它不但直接参与核糖体的生物合成与成熟，还直接或间接参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程［１］。另有研究表明，核仁素蛋白的断裂和转位改变与细胞凋亡的发生相关［２，3］。因此，本研究拟建立能够稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞，为研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供理想的细胞模型。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    质粒pCMV-Tag2B-Nuc由德国Hamburg-Eppe大学细胞生物化学与临床神经生物学研究所Stefan Kindler教授惠赠；H9C2细胞株由中南大学细胞中心提供；DMEM培养基，Gibco公司产；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠或羊抗兔或羊抗小鼠IgG，Sigma公司产；无支原体胎牛血清，杭州四季清生物工程公司产；LipofectamineTM2000转染试剂盒，Invitrogen life technologies公司产。鼠抗C23单克隆抗体，Santa Cruz公司产；质粒抽提试剂盒，大连TaKaRa公司产；DAB显色试剂盒，武汉博士德生物技术公司产；Trizol试剂，Gibco BRL公司产。

    1.2.  H9C2细胞培养

    大鼠心肌细胞株（H9C2）用含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞于37 ℃，5% CO2条件下培养，待细胞生长至约85%的融合状态用于实验。

    1.3  质粒扩增、抽提及鉴定

    质粒转化感受态细菌DH5α，挑取阳性克隆进行扩增；质粒抽提依试剂盒说明书进行；用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒，一部分1％琼脂糖胶电泳，拍照；另一部分送上海博亚生物技术有限公司测序。

    1.4  脂质体转染

    根据生命技术公司提供的转染操作说明书进行。细胞用无血清DMEM培基洗涤3次后，加入质粒与脂质体的混合物，37 ℃，5%的CO2培养箱中培养，6 h后再加入4 mL含10%小牛血清的DMEM培基，24 h后，按1∶10进行分瓶培养。第2 d加入含1 000 μg/mL G418和10%胎牛血清的DMEM培养基进行筛选4周。同时转染pCMV-Tag2B空载体，用G418进行同样筛选后用于对照。

    1.5  免疫印迹

    按实验室常规方法进行。用2×SDS裂解缓冲液裂解细胞，收集细胞总蛋白质，采用Bradford法进行蛋白定量，30 μg蛋白经10%～12% SDS-PAGE电泳6 h后，电转（4 ℃，过夜）至PVDF膜，2%BSA室温封闭3 h，先后加入靶蛋白抗体及HRP标记的相应IgG，室温分别孵育1 h和0.5 h，DAB显色试剂盒进行显色。

    1.6  细胞总RNA提取

    按实验室常规方法进行。弃培养液，加1 mL Trizol/2×106细胞，裂解细胞，细胞裂解物转移到2 mL Eppdorf管中，室温放置5 min，加0.2 mL氯仿/1 mL Trizol，剧烈震荡15 s，室温放置3 min，4 ℃离心，细胞裂解液分为三层，小心吸取上层水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，加0.5 mL异丙醇/1 mL Trizol，室温放置10 min，4 ℃离心，小心去掉上清，加1 mL 75％乙醇洗白色沉淀物，离心后去掉乙醇，空气干燥约10 min，用10 μL～20 μL DEPC处理过的水重悬RNA，测量1∶100稀释样品的光密度（OD260）来浓度。浓度（μg/mL）=(稀释度)［（40 μg/mL.OD260）］(样品的OD260)，重悬的RNA放置-80　℃冰箱保存。

    1.7  逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

    用逆转录酶MMLV合成第一链。根据公司提供的使用说明书进行。取1 μg RNA与oligDT在70　℃反应 5 min，置于冰上，加入dNTP、buffer、Rnasin，37 ℃反应5 min后置于冰上；加入MMLV，42　℃反应1 h，72 ℃反应10　min。用2.5 μL的逆转录产物作为模板，按如下的反应条件进行PCR扩增：

    C23：F:cgcggatcccatggtgaagctcgc； B：cggggtacctattcaaacttcgtcttct

    94 ℃变性30　s，55　℃退火30　s，72　℃延伸2　min，扩增31个循环；

    GAPDH：F：acccagaagactgtggatgg  B：ttctagacggcaggtcaggt

    94 ℃变性30　s，58　℃退火30　s，72　℃延伸1　min，扩增22个循环。

    2  结果

    2.1  质粒鉴定

    质粒pCMV-Tag2B-Nuc经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，产物在一部分1％琼脂糖胶电泳，另一部分送上海博亚生物技术有限公司测序。将未经酶切质粒与质粒酶切产物均行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。酶切产物出现约2.1 kb大小片段，大小与预期一致。测序结果与GenBank中公布的序列符合（测序结果未展示）。

   2.2.  核仁素mRNA在H9C2细胞中的表达

    以细胞的总RNA为模版，以特异性的引物经RT-PCR扩增出大小约为2.1 kb的片段，其长度与预期一致(见图2)，稳定表达核仁素的H9C2细胞RNA表达水平较野生型与转空载体细胞明显增高，以GAPDH作为内对照。

    2.3.  核仁素在H9C2细胞中的表达

    经Western blot检测，转pCMV-Tag2B-Nuc细胞与野生型细胞和转空载体细胞相比，核仁素表达水平明显升高(见图3)。

    3  讨论

    细胞凋亡在生物体的胚胎发育、器官形成等生理状态，以及神经退形性变、肿瘤发生、脑梗死、心衰等病理过程中均起重要作用［４］。作为一种定位于核仁的磷酸蛋白，核仁素在细胞凋亡中的作用一度被忽视，但随着其功能的不断发掘，核仁素在细胞凋亡中的作用越来越突出，已被列为细胞凋亡相关蛋白中的一员［２，３，５］。Kito［２］等发现大田酸诱导Soas-2细胞凋亡过程中伴有核仁素表达下调；Otake［６］等发现类维生素A诱导HL-60细胞凋亡时伴有核仁素表达下调；Alvarez等［７］研究发现核仁素表达上调可导致核仁组份分离，破坏核仁结构；我室的研究也表明，过氧化氢模拟的体外氧化应激所致C2Cl2细胞及原代心肌细胞凋亡早期也有明显的核仁素蛋白的断裂及表达下调，并且用核仁素反义寡核苷酸人为阻断核仁素表达后发现，细胞凋亡发生明显增多，在C2C12细胞达23.4%而在RAW264.7 巨噬细胞高达35.6%，并且热休克蛋白可以抑制氧化应激所导致的细胞凋亡及核仁素表达下调［８］。但在细胞凋亡的发生中，有关核仁素如何发挥作用等问题，仍不甚了解。

    本实验通过将含核仁素全长的质粒转染入H9C2大鼠心肌细胞，并使用G418进行筛选，得到稳定表达的细胞克隆，避免了瞬时转染操作繁琐，重复性较低的缺点。所得到的细胞克隆在形态上与野生型H9C2细胞无明显差别。筛选4周，并经反复冻存与复苏后，经RT-PCR及Western blot分别检测核仁素mRNA与蛋白表达水平，较野生型和转空载体细胞均明显升高，提示核仁素在传代细胞中稳定表达。稳定表达核仁素的大鼠H9C2心肌细胞株的建立，为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供了良好的工具。

【】
  ［１］ Andersen JS, Lyon CE, Fox AH,et al.Directed proteomic analysis of the human nucleolus.Curr Biol，2002，12(1):1～11.

［２］ Kito S, Shimizu K, Okamura H,et al． Cleavage of nucleolin and argyrophilic nucleolar organizer region associated proteins in apoptosis-induced cells. Biochem Biophys Res Commun，2003，300(4):950～956．

［３］ Mi Y, Thomas SD, Xu X, et al.Apoptosis in leukemia cells is accompanied by alterations in the levels and localization of nucleolin.J Biol Chem，2003，278(10):8572～8579.

［４］ Mehmet H. Apoptosis: Caspases find a new place to hide. Nature［Ｊ］，2000,403(6765):29～33．

［５］ Martelli AM, Zweyer M, Ochs RL, et al. Nuclear apoptotic changes: an overview［Ｊ］.JC ellBiochem,2001，82(4):634～646.

［６］ Otake Y,Sengupta TK,Bandyopadhyay S,et al． Retinoid-induced Apoptosis in HL-60 Cells is Associated with Nucleolin Down-Regulation and Destabilization of Bcl-2 Mrna. Mol Pharmacol，2005,67(1):319～326．

［７］ Alvarez M, Quezada C, Navarro C,et al.An increased expression of nucleolin is associated with a physiological nucleolar segregation［Ｊ］.Biochem Biophys Res Commun,2003，301(1):152～155．

［８］ 王慷慨，蒋磊，刘可，等.热休克蛋白70对氧化应激所致核仁素裂解的影响［Ｊ］.动脉硬化杂志，2004,12(4);373～377.