原发性肝癌组织中肝素酶表达与肝癌侵袭 转移关系的研究
作者：罗志强 刘锋 邵江华 邬林泉
【摘要】 目的 探讨乙酰肝素酶( Heparanase Hpa) 在肝癌中的表达及其与肝癌临床病理特征的关系。方法 分别采用RT-PCR 和免疫组织化学法检测Hpa mRNA 及Hpa 蛋白在肝细胞肝癌、癌旁肝组织及肝癌细胞株中的表达。结果 肝癌Hpa mRNA和蛋白的表达显著高于癌旁及正常肝组织(P<0.05) ,肝癌组织中Hpa mRNA 的表达与TNM 分期、Edmondson 分级和复发有关(P<0.05) 。结论 Hpa mRNA 及蛋白在肝癌中高表达,并与肝癌的侵袭转移、复发、预后有关。
【关键词】 肝细胞肝癌 乙酰肝素酶 侵袭 转移 复发
【Abstract】 Objective The main aim of this investigation is to explore the expression of heparanase mRNA and protein in hepatocellular carcinoma ( HCC) and its relationship with the clinical pathological features of HCC. Methods Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical staining were used to detect expression of heparanase mRNA and protein in normal hepatic tissues, tumor tissues and adjacent tissues of hepatocellular carcinoma. Results The expression of Hpa mRNA and protein in HCC tissues was significantly higher than that in adjacent tissue and normal hepatic tissues (P<0.05) . It was correlated with TNM classification and recurrence of HCC Edmondson-Steiner’s classification (P<0.05) . Conclusion Overexpression of the heparanase mRNA and protein relates to the invasion , metastasis , recurrence and prognosis of hepatocellular carcinoma.
【Key words】 Hepatocellular carcinoma Heparanase Invasion Metastasis Recurrence 乙酰肝素酶( heparanase , HPA) 是1999 年克隆分离出的一种葡糖苷酸内切酶。它可降解硫酸乙酰肝素(hearan sulfate ,HS) ,破坏细胞外基质和血管基底膜,并促进肿瘤新生血管生成,使肿瘤细胞实现侵袭转移。作者运用RT - PCR 和免疫组织化学法对Hpa mRNA 及Hpa 蛋白在肝细胞肝癌、癌旁肝组织及肝癌细胞株中的表达进行检测,检测33例原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC) 标本中HPA 的基因表达,并结合病人的临床病和随访资料,以探讨HPA 可否作为HCC 转移潜能的可靠标志。
1 临床资料
1.1 一般资料 新鲜冷冻的标本取自2005 年8 月至2006年4 月南昌大学第二附属普外科手术切除并经病理学检查证实的33 例HCC(包括癌和癌旁肝组织) 和9 例肝脏良性肿瘤(取瘤旁肝组织作正常对照)。收集病人临床病理学检查资料,HCC 组中男28 例,女5 例;年龄29～73 岁,平均49 岁。28 例术后6～16 个月内获得随访,占85 %(28/ 33) 。根据手术记录、术后病理学检查报告等,将有癌栓、肝内播散即卫星癌灶和(或) 淋巴结转移的14 例HCC 病人定为高转移复发倾向组。反之,无癌栓、肝内卫星癌灶和(或) 淋巴结转移的19 例HCC 病人为低转移复发倾向组。其中癌灶长径≤5 cm 8例,＞5 cm 25例;癌灶包膜完整14 例、不完整19 例;甲胎蛋白(AFP) 阳性26 例、阴性7例; HBsAg 阳性27 例、阴性6 例;合并明显肝硬化18例、无明显肝硬化15 例;肿瘤Edmondson Ⅰ、Ⅱ级13 例、Ⅲ、Ⅳ级20 例; TNM Ⅰ、Ⅱ期18 例、Ⅲ、Ⅳ期15 例。随访有和无转移复发各14 例。肝脏良性肿瘤9 例中男4 例,女5 例;年龄32～65 岁,平均41 岁;其中肝海绵状血管瘤8 例、肝局灶性结节性增生1 例。
1.2 总RNA 提取和半定量RT-PCR 检测 Trizol 总RNA 分离试剂盒( Gibco) Trizol 一步法提取组织总RNA ,甲醛变性胶电泳鉴定及紫外分光光度仪测定OD 值后,逆转录合成cDNA。AMV 为TaKaRa 公司产品,dNTP 购自上海生物工程公司。HPA 引物参照［１］设计,由上海生物工程公司合成, 上游为5’-2 TTCGATCC2CAAGAAGGAATCAAC23 ’, 下游为5-2 GATTCAGTTA2CATGGCATCACTAC-3’,其扩增片段长度为585 bp 。采用β2actin 作为内参照,其引物由上海博亚生物公司合成,上游序列为5’2 TTCCAGCCTTCCTTCCTGG23 ’, 下游为5’2ATTGCTCCTCCTGAGCGCAA23’,扩增片段长度为224 bp。按50μl 反应体系行PCR 扩增。Tag TM DNA 聚合酶为TaKaRa产品。HPA 扩增条件为94 ℃预变性4 min ,后转入94 ℃变性30 s、57 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min 循环,共35 个周期,然后再72 ℃延伸5 min。取10μl 产物于112 %的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭紫外灯下观察拍照。
1.3 免疫组织化学染色方法及结果判定 标本常规甲醛固定取材、脱水、石蜡包埋后做4μm 连续切片,按SP 免疫组织化学染色试剂盒染色步骤进行, Hpa 表达阳性为细胞浆染成棕黄色,在光镜下观察5 个高倍视野,阳性细胞数,阳性细胞数≤10 %为阴性表达, > 10 %为阳性表达。
1.4 统计学处理 结果数据采用χ2 检验或四格表确切概率法分析。
2 结果
2.1 HPA mRNA 在肝癌组织中的表达 经RT-PCR 扩增后电泳观察发现33 例HCC 癌组织中有16 例HPA 表达阳性,阳性率为48 %(16/ 33) ;而癌旁肝组织仅1 例HPA 表达呈阳性;9 例正常肝组织均阴性。经统计学处理P 值＜0101 分别(前者χ2 值171827 ,P<01005,后者P<0101) ,有显著性差异。见图1。
２.2 ＨＰＡ 在肝癌组织中的表达 免疫组织化学染色显示１６ 例肝癌组织Hpa 蛋白表达阳性,癌旁组织有5 例表达阳性; 9 例正常肝组织均未见表达; 肝癌与癌旁、正常肝组织的蛋白表达有显著性差异(P<0.05)。见图２。
2.3 HPA mRNA 表达与肝癌临床病理学特征及转移复发的关系 肝癌HPA mRNA 表达与病人年龄、性别、癌灶大小、包膜完整度、HbsAg 状态、AFP 和有无肝硬化等因素无关( P > 0105) ,而与癌灶Edmondson 分级、TNM 分期、转移复发倾向和有无转移复发有关( P < 0105) 。见表1。
图１ 肝素酶ｍＲＮＡ在ＨＣＣ癌及癌周肝组织中的表达(Ｍａｒｋ：ＤＬ２０００；Ｔ１：是某例癌组织标本，于５８５ｂｐ处有条带出现，ＨＰＡ表达阳性；Ｎ１：为相应的癌周组织标本，ＨＰＡ表达阴性) 图2 肝素酶蛋白在癌组织的表达（ｓｐ×２００）表1 HPA mRNA 表达与肝细胞癌临床病理学特征及转移复发的关系
3 讨论
在生理状态下,乙酰肝素酶(Hpa)主要分布在胎盘、脾脏、血小板及中性粒细胞、单核细胞、T 淋巴细胞和B淋巴细胞等免疫细胞内,在肝脏、肾脏及胰腺等均不表达。研究发现Hpa 在结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌等［２，３］多种恶性肿瘤细胞中异常高表达,而相应的正常组织不表达。本实验结果显示,肝癌组织Hpa mRNA 及Hpa 蛋白的表达显著高于癌旁肝组织及正常肝组织(P<0.05) ,正常肝组织不表达,与报道一致。EI-Assal 等［４］运用RT-PCR 研究显示47 %的肝癌组织Hpa mRNA 表达阳性,癌旁组织不表达或微弱表达,正常肝组织不表达。刘颖斌等［５］发现，Hpa表达阳性与原发性肝癌术后转移复发正相关。说明Hpa 的表达可能与肝细胞的恶性转化及肿瘤的演进有关。
硫酸乙酰肝素(HS)是构成细胞外基质和基底膜的基本成分,起着维持基质结构稳定,限制细胞运动及粘附的作用,其降解破坏了基质及基底膜的完整性;同时,使基质中储存的大量生长因子如碱性成纤维因子和血管内皮生长因子释放,加速血管的形成。最终导致肿瘤的侵袭转移。Hulet t 等［６］发现高转移的鼠腺癌细胞系表达高水平Hpa mRNA ,而低转移细胞系仅有少量表达。Gohji 等［７］发现Hpa 蛋白在肌层受侵、有淋巴结转移、临床分期高的膀胱癌组织表达显著升高,显示其与膀胱癌的侵袭转移有关。Vlodavsky 等［８］研究也发现侵袭性乳腺癌比非侵袭组织有更高Hpa 表达。
本研究用RT-PCR 方法检测33 例HCC 标本HPA mRNA 及蛋白的表达情况,结果发现有16 例癌组织中HPA mRNA 及蛋白表达阳性,占总数的48 %(16/ 33) ; HPA 表达与肝癌的病分级、TNM 分期和转移复发有关。提示HCC 中HPA 阳性率较高,HPA 表达与肝癌的病理学分级和TNM 分期有关,癌分化程度越低、分期越晚,其HPA 表达阳性率也越高,与El-Assal 等［９］的研究结果相似。与El-Assal 等的研究不同的是,本研究未发现HPA 表达与癌体积有关,可能是由于本组＜5 cm病例较少(8 例) 。此外, 本研究亦未发现HPA 表达与病毒感染(HBsAg 状态) 、AFP 和肝硬化等因素有关,可能是由于感染的病毒类型不同,El-Assal 等的研究的HCC 病人以HCV 感染为主,而我国HCC 的发生大多与 HBV 感染、肝硬化有关,少有HCV 感染。本组33 例HCC 中有16 例HPA 表达,而癌旁肝组织和正常肝组织几无或仅有少量表达;HPA 表达在高转移复发倾向组和低转移复发倾向组表达率有明显差异,初步表明HPA与肝癌侵袭转移的关系;在转移复发组和无转移复发组表达率亦有显著性差异,进一步提示HPA 表达阳性病人有较高的癌侵袭性和术后复发倾向, HPA 有可能成为HCC 术后转移复发有价值的预测指标。
【文献】
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9 El-Assal ON, Yamanoi A, Ono T, et al. The clinicopathological significance of heparanase and basic? fibroblast growth factor expressions in hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res，2001，7:1299～1305.
