中医药调控再生障碍性贫血免疫异常研究进展

                         作者：李峻，胡明辉，周永明，孙伟玲  

【摘要】  再生障碍性贫血（再障）是一种常见的血液系统难治性疾病，近年研究表明，免疫介导的造血抑制是再障最常见、最重要的发病机制，多年临床实践证实中医药再障疗效确切，而且实验研究从调节淋巴细胞亚群失衡、调控细胞因子紊乱、调节红细胞免疫、再障中医证型与免疫异常相关性等4个方面，揭示了中医药治疗再障的免疫学机理。

【关键词】  再生障碍性贫血；中医药疗法；免疫；辨证分型；

 1 调节淋巴细胞亚群失衡

     众多研究表明，细胞免疫异常是AA发病机制中的主要环节，许多实验研究证实相当比例的AA患者骨髓及外周血T淋巴细胞亚群发生变化（CD4+T细胞明显减少, CD8+T细胞增多，CD4+/CD8+比例下降；Th1细胞比例升高，而Th2细胞相对不足，Th1/Th2平衡向Th1漂移），异常活化T细胞增多（Tc、Th1、γδTCR+T细胞增多），异常寡克隆T细胞存在（多个寡克隆性TCRVβ亚家族T细胞增殖），这些变化可直接或间接导致造血衰竭。此外，还发现AA患者骨髓1型树突状细胞（DC1）亚群失衡，激活的DC1相对于未成熟的DC1明显增多，外周血Th3、Tr细胞数量下降，促进Th0细胞向Thl型极化，使自身免疫耐受被打破、T细胞功能亢进而导致造血功能衰竭。目前认为细胞免疫功能亢进导致造血衰竭的作用途径有直接损伤造血干细胞，抑制其增殖；造成细胞因子分泌紊乱，正负造血因子失调，抑制造血；直接或通过造血因子间接诱导造血干细胞发生凋亡。

     周永明等［1］用健脾补肾活血法为主治疗慢性AA，发现治疗前AA患者CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+显著低于正常对照组，CD8+细胞则明显高于正常对照组，治疗后CD4+细胞增多，CD8+细胞下降，CD4+/CD8+比例趋于正常，并且脾肾阳虚型的改善优于脾肾阴虚型，提示健脾补肾活血法能调整AA患者机体的免疫功能，减少抑制性T细胞数量，从而解除对骨髓造血的抑制。后盾［2］运用右归丸加味治疗慢性再生障碍性贫血（CAA），经治疗6个月后CD4+细胞明显升高，与正常人比较差异无统计学意义，CD8+细胞与治疗前相比明显下降，但仍显著高于正常人，CD4+/CD8+治疗后接近正常。柯微君［3］以补肾为主的方药治疗CAA 56例，结果肾阳虚型有效率为91.3%，优于肾阴虚组的57.5%，治疗后CD4+、CD4+/CD8+ 明显升高，CD8+明显下降，杀伤（NK）细胞活性治疗后升高，推测补肾中药可降低抑制性T细胞，使NK细胞功能恢复以促进造血干细胞增殖分化。周永明等［4］研究表明，生血合剂可改善TCRVβ谱型倾斜程度，降低异常T细胞克隆性增殖，从而减少异常克隆的T细胞对造血组织的免疫损伤，有利于骨髓造血功能的恢复。陆嘉惠等［5］研究证实AA患者外周血γδTCR+T细胞表达明显高于正常组，αβTCR+表达与正常组比较差异无统计学意义，采用具有健脾补肾活血作用的生血合剂治疗后，患者γδTCR+T细胞水平下降，且作用与免疫抑制剂环孢素A相当。黄振翘等［6］报道，再障患者外周血NK细胞活性下降，采用补肾泻肝方治疗后，患者NK细胞活性升高，并且NK细胞活性升高与Ts细胞的下降有关，NK细胞活性变化似可作为观察AA免疫治疗疗效的指标。

     除临床观察外，利用动物实验探索中药干预对淋巴细胞亚群的影响也日见成熟。周永明等［7］在成功改良复制免疫介导AA小鼠模型的基础上，观察了生血合剂对免疫介导AA小鼠动物模型的作用，研究表明生血合剂能降低AA小鼠的死亡率，延长其存活时间；增加外周血象、骨髓有核细胞，作用与康力龙对照组大致相似；增加Th、降低Ts百分值和γ干扰素（γ-IFN）含量，其作用明显优于康力龙对照组。提示生血合剂能调节免疫功能，降低Ts、减少γ-IFN等造血负调控因子的释放，从而促进造血功能恢复。史亦谦等［8］建立免疫诱导AA小鼠模型并分别用益气活血、温补脾肾、扶正解毒中药煎取液灌胃，结果表明这些方药能不同程度提高AA小鼠的Th细胞，降低Ts细胞，使Th/Ts比值升高，减轻免疫异常对骨髓造血组织的抑制和损伤，有利于AA骨髓造血的修复和重建。

    2 调控细胞因子紊乱

     AA患者由于T淋巴细胞亚群及功能的变化，细胞因子的分泌失调，可产生过量的造血负调控因子，从而表现出明显的造血抑制活性。Maciejewski J P等［9］研究发现活化的Ts通过过量分泌造血负调控因子γ-IFN、TNF-α、IL-2来抑制造血。IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子不仅能直接抑制造血细胞的增殖，而且还可通过Fas抗原（CD95）介导的细胞凋亡，诱导CD34+细胞的程序性死亡，从而导致造血衰竭。此外，AA患者体内正调控因子如IL-1、IL-3 、sIL-2R、IL-6、EPO、GM-CSF、干细胞因子（SCF）水平下调，使得造血干/祖细胞增殖、分化功能减退，CFU-GM、BFU-E、CFU-E形成减少。近年来研究发现，AA患者体内负性造血调控因子TGF-β水平下降，而且对治疗反应好的患者TGF-β升高，然而另外一些报道则与之相反。此外，AA患者外周血中NO水平明显高于正常，NO与AA骨髓红系造血功能衰竭密切相关。总之，调控因子间、调控因子与细胞间存在着复杂的相互作用，同种细胞因子在不同外环境影响下亦会通过不同的信号传导通路表达不同的生物学活性。细胞因子、造血调控因子等通过多种不同的途径抑制骨髓造血或加速造血干/祖细胞的凋亡，从而引起AA的发生。

     黄振翘等［10］采用酶联免疫法（ELISA）测定补肾泻肝方治疗前后外周血γ-IFN、IL-2水平，治疗前治疗组γ-IFN、IL-2水平与正常对照组比较明显增高,肾阴虚组与肾阳虚组治疗前后比较差异有统计学意义，故认为补肾泻肝方可能通过降低AA患者体内γ-IFN、IL-2水平,以解除负调控因子对造血的抑制,发挥促进骨髓造血功能恢复的作用。黄韬等［11］采用ELISA法检测AA患者应用补肾泻肝方治疗前中后的血清sIL-2R水平，并分析其与疗效的关系，发现有效病例治疗前中后的血清sIL-2R值有明显差异，且明显高于无效组，显示有效组临床疗效与血清sIL-2R值变化明显相关。俞亚琴等［12］观察了补肾加和解法对AA患者TNF-α、IFN-γ治疗前后的影响，实验结果表明，治疗前两种细胞因子水平较正常对照组明显增高，治疗后明显降低，说明补肾加和解法对AA患者这两种细胞因子有调节作用，并推测补肾加和解法中药可能是通过降低造血负调节因子TNF-α和γ-IFN水平，从而减轻了对造血的抑制作用。徐瑞荣等［13］研究表明，补肾益髓中药可通过抑制TNF-α、IFN-γ表达，增强SCF、IL-3表达，并促进造血生长因子EPO、GM-CSF分泌，而调节AA患者紊乱的免疫状态，解除对造血的抑制，促进骨髓造血。孙伟正等［14-17］报道，补髓生血冲剂可使CAA患者血清中IL-1β水平提高，IFN-γ、TNF-α、TGF-β、IL-6水平及IL-6、IL-8阳性细胞指数降低，从而改善紊乱的免疫状态，促进骨髓造血功能恢复。

     周永明等［18］观察了生血合剂及其拆方对AA模型小鼠的作用，结果表明生血合剂能增高IL-3、sIL-2R水平；降低IL-2、γ-IFN水平和脾细胞γ-IFN基因表达水平；生血Ⅰ号的作用优于生血Ⅱ号；单用健脾、补肾、活血方药对上述指标均有不同程度的作用，其中温肾药优于滋肾药和活血药，活血药优于健脾药，但以全方作用最佳，显示了组方的合理性。丁敬远等［19-22］检测免疫介导AA小鼠骨髓造血细胞在含不同中药血清液体培养体系中IL-3、γ-IFN的浓度，结果发现，滋肾方药、活血方药对IL-3的生成有影响，健脾方药、泻肝方药、温肾方药、滋肾方药、活血方药对培养体系中IFN-γ的生成均无影响，推测滋肾、活血方药临床治疗AA的作用是通过影响IL-3的生成，而补肾、泻肝、活血、健脾方药临床治疗AA确有疗效，可能与影响造血组织局部IFN-γ的生成进而促进造血干/祖细胞增殖、分化有关。冯江等［23］利用补肾生髓Ⅰ号治疗免疫介导AA小鼠发现，治疗后AA小鼠外周血细胞计数、骨髓有核细胞数及GM-CFU显著增高，IL-1、IL-6水平升高，而IL-2水平下降，认为补肾生髓l号可能通过调节细胞因子IL-1、IL-2、IL-6的活性，进而促进骨髓造血重建。

    3 调节红细胞免疫

     CD35、CD58是广泛分布于红细胞膜上的免疫分子，由于红细胞数量众多，其在机体免疫系统中的作用和地位倍受关注。近年来研究证实红细胞不仅具有重要的免疫黏附功能，而且参与T、B淋巴细胞的免疫调控，其机制与红细胞膜分子CD35、CD58密切相关。

     代喜平等［24］ 研究表明，CAA治疗前红细胞C3b受体花环率（RBC-C3bRR）、 CD58分子定量明显低于正常对照组，经用补肾复方冲剂治疗后，RBC-C3bRR、CD58分子定量明显升高，提示补肾复方冲剂可能通过增强红细胞免疫黏附功能，调节机体免疫紊乱，从而促进骨髓造血。

    4 中医证型与免疫异常相关性研究

     辨证论治是中医论治思想的精华所在，将医学理论同中医证侯本质联系，是实现中西医理论结合的基础。免疫异常是AA发病的关键所在，而多年来临床实践证实中医药辨证治疗AA疗效肯定，因而从20世纪80年代末开始陆续有人对AA证型与异常免疫指标之间的关系进行了探讨，以探求AA辨证分型的客观基础。

     麻柔［25］研究表明，CAA按照气血两虚、肾阳虚、肾阴虚、肾阴阳两虚的顺序，患者辅助性T细胞（Th）逐渐降低，抑制性T细胞（Ts）逐渐升高，Th/Ts明显降低，后两组比前两组Th/Ts下降更显著，提示阳损及阴时机体免疫功能发生更大的改变，从T细胞亚群水平揭示了中医证型的实质。周永明等［1］研究发现AA患者免疫指标的改变以脾肾阴虚型尤为显著，说明脾肾阴虚型免疫功能紊乱较脾肾阳虚型为重，两型之间差异显著的指标有NK细胞、CD4、CD8、CD4+/CD8+，说明中医辨证分型有其客观的物质基础，这些指标似可作为AA辨证分型的依据，而IL-2、CD3等指标对AA辨证分型似无意义。刘宝山等［26］探讨CAA不同证型与骨髓细胞凋亡及T细胞活化的相关性，结果表明，骨髓单个核细胞凋亡率由低至高，依次为脾肾阳虚组、肾阴阳两虚组、肝肾阴虚组，且三组CD25+阳性率、CD3+CD25+阳性率均高于正常对照组，三型比较以肝肾阴虚组阳性率最高，肾阴阳两虚组次之，脾肾阳虚组最低，故CD25+阳性率、CD3+ CD25+阳性率可以作为CAA辨证分型的依据。孙伟正等［27］研究CAA不同证型患者的HLA基因多态性，结果发现，HLA-CI基因可能与肾阴虚型CAA的易感基因呈现连锁不平衡，故其可能为肾阴虚型CAA易感基因的标志基因；HLA-A30基因可能与肾阳虚型CAA的易感基因呈现连锁不平衡，故其可能为肾阳虚型CAA易感基因的标志基因，HLA-DQB1*0201基因也可能是肾阳虚CAA的易感基因。黄韬等［28］观察补肾泻肝方治疗AA的临床疗效与INF-γmRNA基因表达之间的关系，结果发现，INF-γmRNA基因表达在中医辨证分型和预测补肾泻肝方的疗效与治疗机理方面有重要的作用。胡琦等[29]研究表明，CAA肾阳虚、肾阴虚组之间血清C3、C4含量和T细胞亚群表达存在显著差异，前者C3、C4含量明显降低，后者CD8+细胞高表达且血清C3含量与CD8+细胞表达呈正相关，与CD4+/CD8+比值呈负相关，还有研究发现，CAA肾阳虚证患者外周血中性粒细胞膜CD59+表达率较健康对照组轻度减少，但骨髓CD34+、CD55+和CD59+细胞膜表达率与骨髓对照组比较差异无统计学意义［30］。唐旭东等［31-33］应用统计判别方程方法，筛选53项免疫学指标，建立再障中医证型判别方程，对AA中医证型客观量化，筛选出CD45RA+绝对值、CD3+CD25+绝对值、CD3+CD25+（％）、CD3+HLA-DR+绝对值和CD4+γδT（％）等5个最有意义的免疫指标，其判别总正确率为76.5％，CD45RA+绝对值在AA辨证分型中变化显著，CD3+HLA-DR+绝对值在肾阳虚组与对照组比较差异有统计学意义，CD3+CD25+、CD3+HLA-DR+在预后不良的肾阴虚组偏高，在预后较好的肾阳虚组偏低，而在肾阴阳两虚组居中，肾阳虚组中CD4+γδT（％）显著升高，肾阴虚组CD4+γδT绝对值显著降低，肾阴阳两虚组各值与对照组比较差异无统计学意义，故CD45RA+绝对值、CD4+γδT（％）、CD3+CD25+绝对值、CD3+CD25+（％）CD3+HLA-DR+绝对值在AA不同证型中变化具有一定，对辨证分型及预后判断有一定意义。

    5 结   语

     随着AA的免疫发病机制的逐步阐明，中医药对AA免疫功能影响的研究日趋活跃。通过临床上设立对照组，建立动物实验模型，已逐渐深入到分子、基因水平，找到了一些中医药AA、调节免疫的客观依据。但我们也应该看到有关AA中医证型与免疫学客观指标的研究还不系统，在利用技术如基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、代谢组学、系统生物学、表观遗传学等方面还跟不上现代医学的。如何进一步提高中医药治疗AA的疗效，阐明中医药多环节、多靶点的疗效机理，是目前研究中医药治疗AA的难点。应建立现代免疫指标与AA不同中医证型疗效及预后的联系，充分利用现代医学技术方法，并与中医理论方法结合，取长补短，以最大程度提高临床治疗AA的疗效。利用动物模型、细胞培养体系等，采用高通量、大规模实验方法及统计与机分析的现代技术如功能基因组学、蛋白质组学等方法，建立中药复方有效组分筛选体系，以更地遣方组药，以利于新药的开发及临床疗效的提高。

     由于辨证论治是中医学的特色，不但不能丢，而且要不断发扬，因此如何利用免疫学、遗传学新技术并与中医辨证相结合，深入研究中医药治疗AA调节免疫的物质基础、作用机理，寻找免疫学指标与AA中医证型的关系，建立AA中医治疗疗效的“预报因子”体系以优化AA中医个体化治疗，将成为中医药研究者面临的新课题。

【】
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