磷脂酶A2抑制剂对急性胰腺炎肠黏膜损伤的保护研究

【摘要】  目的 探讨应用磷脂酶A2(PLA2)抑制剂对大鼠重症急性胰腺炎(SAP) 时肠黏膜损伤的保护作用及其机制。方法 雄性Wistar大鼠36只，随机分为3组(n=12)：假手术组(SO组)、SAP组、PLA2抑制剂组(抑制剂组)。胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠诱导SAP模型，治疗组在造模后30min腹腔注射PLA2抑制剂S5920/LY315920Na(0.5mg/100g)。各组于术后12h点处死大鼠，观察胰腺和肠黏膜组织病变化，检测血清淀粉酶(AMY)、血清和肠黏膜组织中sPLA2活性的变化，RT?PCR法检测肠黏膜组织sPLA2 mRNA表达。结果 SAP组胰腺和肠黏膜组织病理改变明显，血清AMY水平、IL?1β含量、血清和肠组织sPLA2活性、sPLA2 mRNA表达水平均明显高于SO组(P<0.05)。PLA2抑制剂治疗组胰腺和肠黏膜组织病理损害程度较轻，上述指标均明显低于SAP组(P<0.05)，但仍高于SO组(P<0.05)。结论 PLA2抑制剂可通过降低血清IL?1β、抑制sPLA2 mRNA表达和下调血清及肠组织PLA2的活性等减轻SAP大鼠肠黏膜损伤。

【关键词】  急性胰腺炎;磷脂酶A2抑制剂;肠黏膜损伤

　　ABSTRACT：Objective To investigate the protective effects of phospholipase A2 inhibitor on severe acute pancreatitis(SAP)?associated intestinal mucosal injury in rats and its mechanism.Methods Thiry?six male Wistar rats were randomly divided into sham operation group (SO group),SAP group and phospholipase A2 inhibitor treatment group (inhibitor group).SAP model was induced by retrograde infusion of 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct,and the inhibitor group was injected intraperitoneally with phospholipid A2 inhibitor S5920/LY315920Na(0.5mg/100g) 30min afte SAP model.Rats in all groups were executed at 12h after induction,the pathological changes of pancreas and intestinal mucosa were observed, and serum amylase,IL?1β contents and sPLA2 activity as well as sPLA2 activity in intestinal tissue were determined.The expression of sPLA2 mRNA in intestinal tissue was measured.Results In SAP group,the pathological changes of pancreas and intestinal mucosa were obvious,amylase,IL?1β contents in serum,sPLA2 activity in serum and intestinal tissue,and the expression of sPLA2 mRNA were significantly higher than those in SO group.The corresponding values in inhibitor group were lower than SAP group(P<0.01), but were higher than SO group (P<0.01). Conclusion Phospholipase A2 inhibitor has protective effect on intestinal mucosal injury in SAP rats through down?regulating the expression of sPLA2 mRNA and decreasing IL?1β level and sPLA2 activity in serum and intestinal tissue.

　　KEY WORDS：Acute pancreatitis;PhospholipaseA2 inhibitor;Intestinal mucosal injury 重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是临床内科较为常见和棘手的一种危重疾病。SAP时常伴有肠道细菌移位、内毒素血症和多系统器官功能不全(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，主要与肠壁组织的循环灌流不足和炎症介质释放所致的肠黏膜屏障功能受损有关[1]。磷脂酶A2(PLA2)是炎症反应中的重要致伤因子，sPLA2作为PLA2最主要的亚型，能水解生物膜上的卵磷脂而引起一系列炎症介质的释放[2～6]。本研究旨在探讨sPLA2激活在牛磺胆酸钠(STC)诱导大鼠SAP模型肠黏膜损伤中的致伤机制，并观察PLA2抑制剂对其的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　STC购自美国Sigma公司，使用前无菌生理盐水配置。特异性PLA2抑制剂(S5920/LY315920Na)购自Promega公司。sPLA2活性分析试剂盒检测购自美国Cayman公司。白介素?1β(IL?1β) ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。PCR和cDNA逆转录试剂盒购自MBI公司，TRIzol RNA抽提试剂、sPLA2、β?actin引物均购自Invitrogen公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组和模型制备

　　雄性Wistar大鼠36只，体质量200～250g(咸宁学院实验动物中心提供)，随机分为3组(每组12只)：假手术组(SO组)、重症急性胰腺炎组(SAP组)、PLA2抑制剂治疗组(抑制剂组)。实验前12h禁食不禁饮。SO组：以1%戊巴比妥钠(0.6ml/100g)麻醉，严格无菌操作下行上腹正中切口，开腹后仅翻动十二指肠和胰腺即关腹;SAP组：5%STC溶液(0.1ml/100g)沿胰胆管逆行恒速(0.1ml/min)注射造模。抑制剂组：造模后30min，腹腔注射抑制剂S5920/LY315920Na 5mg/kg(液体总量为0.2ml/100g)。术后各组每只大鼠均皮下补液(2ml/100g)。

　　1.2.2 标本采集

　　各组动物术后12h分批剖杀，下腔静脉采血测定血清淀粉酶、IL?1β含量和sPLA2活性。切取胰腺头部和距回肠末端5cm处肠管组织约2cm，再切分为三部分，分别以10%甲醛固定用于组织病理学观察，组织匀浆取上清液待测肠组织sPLA2活性，置于-80℃冻存待测sPLA2 mRNA表达。

　　1.3 检测指标

　　1.3.1 血清指标检测

　　淀粉酶(AMY)采用本院检验科临床使用的全自动生化分析仪测定;IL?1β含量采用ELISA法测定，严格按照说明书规定步骤操作。

　　1.3.2 sPLA2活性测定

　　血清和肠组织匀浆上清液sPLA2活性测定严格按照sPLA2活性分析试剂盒说明进行，采用比色法检测。

　　1.3.3 组织病理学观察

　　光镜下观察胰头部胰腺组织和肠组织病理改变。肠黏膜损伤参照Chiu[3]分级标准，病理改变由轻到重分为0级到～Ⅴ级。

　　1.3.4 肠组织sPLA2 mRNA表达

　　取100mg肠组织，异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，按试剂盒说明合成第一链cDNA;取1μl cDNA为模板用PCR试剂盒进行扩增。引物序列如下，sPLA2(309bp)上游：5'?GCTTCTACGGTTGCCATTGT?3';下游5'?AACTGGGCGTCTTCCCTTT ?3';β?actin(207bp)上游5'?CCAACTGGGACGATATGGAG?3'，下游5'?CAGAG?GCATACAGGGACAAC?3' (Invitrogen公司设计合成)。反应条件：sPLA2为94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环。经1.5%琼脂糖凝胶电泳，以sPLA2与β?actin条带光度的比值表示sPLA2 mRNA的表达水平。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS13.0统计软件进行分析处理， 数据以±s表示，多组间进行单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 血清AMY和IL?1β含量测定

　　SAP组AMY和IL?1β含量较SO组升高(P<0.05);抑制剂组后上述指标较SAP组降低(P<0.05)，但仍高于SO组(P<0.05)。(表1)

　　2.2 血清和肠组织sPLA2活性测定

　　SAP组血清和肠组织sPLA2活性较SO组升高，差异有显著性(P<0.05);抑制剂组治疗后血清和肠组织sPLA2活性较SAP组降低(P<0.05)，但仍高于SO组(P<0.05)。(表2)表1 3组大鼠血清AMY、IL?1β含量比较与SO组比较，*P<0.05;与SAP组比较，△P<0.05表2 血清和肠组织sPLA2活性[nmol/(min·L)]、sPLA2 mRNA表达比较 与SO组比较，*P<0.05;与SAP组比较，△P<0.05

2.3 胰腺和肠黏膜组织病检查

　　SO组胰腺和肠黏膜组织未见明显病理改变。SAP组胰腺结构被破坏，腺泡水肿、出血、坏死明显，大量炎症细胞浸润，病理改变明显，抑制剂治疗后上述病理损伤程度较SAP组明显减轻。SAP组肠黏膜Gruenhagen′s腔形成，毛细血管充血、扩张、出血，固有层绒毛脱落甚至消失，腺体明显受损，抑制剂组肠黏膜病理损伤情况明显减轻。(表3)表3 各组肠黏膜损伤情况

　　2.4 肺组织sPLA2 mRNA表达

　　sPLA2 mRNA在SO组呈轻度表达;SAP组表达水平明显升高，与SO组比较差异有统计学意义(P<0.05)。抑制剂组sPLA2 mRNA表达较SAP组降低(P<0.05)，但仍高于SO组(P<0.05)。(表2)

　　3 讨 论

　　质膜、细胞器的PLA2一般分为3种类型：分泌型(sPLA2)、胞质型(cPLA2)和Ca2+非依赖型，其中sPLA2是最主要的亚型。PLA2作为一种在细胞信号传导中起“扳机”样作用调控脂类介质产生、释放的关键酶，其异常表达及血循环中的过度释放可造成大量炎症介质释放与膜功能变化[5, 6]。PLA2及其代谢产物如前列腺素(PGI2)和血栓素(TXA2)均具有强烈的生物活性，广泛参与各种细胞活动如信号转导、炎症过程等[7]。

　　IL?1β是一种强烈的炎症细胞因子，除调节T细胞和B细胞介导的免疫功能外，还作用于中性粒细胞和血管内皮细胞并激活其他炎症介质[6,7]。Mchowat等[8]研究认为炎症反应过程产生的多种细胞因子如IL?1β、TNF?α等可促使PLA2激活，PLA2激活可诱导IL?1β的产生，而IL?1β又可刺激组织细胞内PLA2基因表达，两者相互促进、关联，从而导致细胞、组织损伤。本实验表明，在SAP大鼠，胰腺和肠黏膜病理损伤较SO组明显加重，血清AMY、IL?1β和PLA2活性明显升高，肠组织sPLA2活性和sPLA2 mRNA表达水平亦升高。因此，我们推测，SAP时IL?1β等细胞因子促进sPLA2活化增加，并与其代谢物PGI2和TXA2等脂质介质发挥作用，产生氧自由基及脂质过氧化，导致组织血液动力学紊乱和微循环障碍，引起肠黏膜组织损伤，屏障功能降低。sPLA2激活对肠黏膜细胞的损伤作用可能与以下因素[2,4,9]有关：①可能通过代谢途径产生大量脂类介质，加重肠黏膜微循环障碍;②可能通过破坏细胞的脂质膜使细胞坏死而损伤组织;③肠道黏膜屏障损伤导致细菌移位和内毒素血症，进而使炎性细胞广泛浸润，促进IL?1β、TNF?α等细胞因子和一些粘附分子如ICAM?1等的过度表达，引发“瀑布样级联反应”。我们的实验表明，应用特异性PLA2抑制剂S5920/LY315920Na能明显下调SAP时血清IL?1β含量、肠组织sPLA2 mRNA表达水平和sPLA2活性，并减轻胰腺和肠黏膜的病理损伤，达到了改善SAP肠黏膜损伤的目的。

　　综上所述，sPLA2激活和组织局部sPLA2含量增加参与了STC诱导的SAP肠黏膜损伤的过程，IL?1β在其中亦发挥了重要作用。但具体的作用机制还需更深入的研究。应用PLA2抑制剂对胰腺炎及其并发的肠黏膜损伤起到了保护作用，这为临床治疗急性胰腺炎肠黏膜损伤及改善预后提供了理论支持。

【】
  　　[1]张建新,翟建国,程国祚,等.急性坏死性胰腺炎模型大鼠肠血流量及血清磷脂酶A2、白介素?1β的变化[J].基础医学与临床,2003，23(5):556

　　[2]Tariq M,Elfaki I,Khan HA,et al.Bromophenacyl bromide,a phospholipase A2 inhibitor attenuates chemically induced gastroduodenal ulcers in rats[J].World J Gastroenterol，2006，12(36):5798

　　[3]Chiu CJ,Ardle AH,Brown R,et al.Intestinal mucosal lesion in low flow state[J].Arch Surg,1970,101:478

　　[4]Rahman SH, Ammori BJ,Holmfield J,et al.Intestinal hypoperfusion contributes to gut barrier failure in severe acute pancreatitis[J].J Gastrointest Surg,2003,7(1):26

　　[5]Murakami M.Hot topics in phospholipase A2 field[J].Biol Pharm Bull,2004,27(8):1179

　　[6]Zayat M,Lenard M.Pathophysiology of LPS?induced gastrointestinal injury in the rat:role of secretory phospholipase A2[J].Shock，2008，30(2):206

　　[7]Schwemmer M,Aho H,Michel JB.Interleukin?1β induced type IIA secreted phospholipase A2 gene expression and extracellular activity in rat vascular endothelial cells[J].Tissue Cell, 2001,33(3):233

　　[8]Mchowat J,Liu S.Interleukin 1beta simulate phospholipase A2 activity in adult rat ventricular myocytes[J].Am J Physiol,1997,272:450

　　[9]Leveau P,X Wang,Z Sun,et al.Severity of pancreatitis?associated gut barrier dysfunction is reduced following treatment[J].Biochemical Pharmacology,2005,69(9):1325