麦芽醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后iNOS的影响
【摘要】 目的 观察麦芽醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的影响。方法 建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌流模型，应用免疫组织化学方法检测脑组织中iNOS的表达。结果 脑缺血再灌注损伤后，脑组织中iNOS表达明显增强，给予麦芽醇后，iNOS表达减弱。结论 麦芽醇可抑制iNOS表达，对脑缺血再灌注损伤有保护作用。
【关键词】 麦芽醇;脑缺血;再灌注损伤;诱导型一氧化氮合酶
ABSTRACT：Objective To investigate the effects of maltol on the expression of iNOS after focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats.Methods The model of ischemia reperfusion injury was established by transient middle cerebral artery occlusion(MCAO).The expression of iNOS was analyzed by immunohistochemistry.Results The expression of iNOS was increased significantly after cerebral ischemia reperfusion.Treatment with maltol could markedly inhibit the expression of iNOS.Conclusion maltol may protect cerebral ischemia reperfusion injury by reducing the expression of iNOS.
KEY WORDS:Maltol;Cerebral ischemia;Reperfusion injury;Inducible nitric oxide synthase
目前已经确定的一氧化氮合酶亚型有3种，分别称为神经元型NOS(neuronal NOS,nNOS)、诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)和内皮型NOS(endotheial NOS,eNOS)。脑缺血再灌注损伤后NOS活性明显增加，加重局灶性脑缺血损伤[1]。麦芽醇是从红参中提取的单体化合物，其在体内外可与自由基结合，对脑缺血再灌注损伤有保护作用[2，3]。为了深入研究麦芽醇抗脑缺血的机制，我们观察了麦芽醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后iNOS的影响。
1 材料与方法
1.1 试验动物和分组
成年健康雄性SD大鼠36只，体质量230～280g，清洁级，武汉大学基础医学院试验动物中心提供。随机分为对照组、缺血再灌注组和麦芽醇组，每组12只。
1.2 大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型的建立
参照Koizumi等[4]方法制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞及再灌流模型。采用10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉,术中维持动物肛温(36.6±0.5)℃，颈部正中切口，分离并结扎左侧颈总动脉、颈外动脉, 注意避免刺激迷走神经。从颈总动脉分叉处插入4.0 丝线,沿颈内动脉进入距颈总动脉分叉处1.8～2.0cm 略感阻力时停止;30min 后拔出丝线进行缺血再灌注。术后在约20℃的空调环境下单笼饲养,自由进食、进水。对照组只暴露血管。
1.3 麦芽醇给药
有关[5]，麦芽醇组分别在缺血前和缺血后30min经尾静脉注射2ml 700μmol/L麦芽醇生理盐水。
1.4 免疫组化检测iNOS的表达
大鼠在脑缺血30min再灌注24h后经水合氯醛腹腔麻醉，开胸经主动脉插管，剪开右心房，以200ml生理盐水经升主动脉快速冲洗。随后灌注冷的(4℃)4%多聚甲醛固定液350ml，开颅取出全脑，修块保留缺血中心区(前囟后1.8mm)后固定于相同固定液中6h，入25%蔗糖至组织块下沉。AO恒冷箱切片机连续冠状切片，片厚20μm。对脑组织冰冻切片进行iNOS表达的检测，蒸馏水新鲜配置3% H2O2，室温浸泡5～10min以灭活内源性酶，滴加正常山羊血清30min，不洗，甩去多余液体;滴加兔抗鼠iNOS一抗(1∶400，北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温下(25℃)孵育2h，然后在4℃下过夜，PBS洗;滴加生物素化山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司,二抗试剂盒)室温下30min，PBS洗;滴加辣根酶标记的链酶卵白素稀释液,室温孵育45min，PBS洗10min×3次;DAB显色，室温下15min，双蒸水多次洗涤;脱水、透明，中性树胶封片。显微镜下观察，阳性细胞呈棕黄色颗粒。
1.5 图像分析和统计学处理
每组动物取10张切片，每张切片选取左右皮层，用HPIAS?100高清晰度彩色图文分析系统对其免疫反应产物进行吸光度测定。所得实验数据输入机用SPAS软件进行统计学处理，结果以均数±标准差(±s)表示，并以方差分析，P<0.05为差异显著性标准。
2 结 果
iNOS免疫反应反应产物为棕褐色颗粒或点状，分布于胞浆。缺血再灌注组iNOS在皮层和海马大量表达，与正常对照组相比染色明显加深。麦芽醇组iNOS在皮层和海马阳性表达与缺血再灌注组比较染色明显减弱。(图1)
对各组大鼠皮层经HPIAS?100高清晰度彩色病理图文分析系统测定其吸光度，并经包于该系统内的统计学软件处理(方差分析)，定量分析结果显示：缺血再灌注组iNOS在皮层和海马的吸光度较正常对照组相同脑区显著上升(P<0.05);麦芽醇组在皮层和海马吸光度较缺血再灌注组显著降低(P<0.05)。(表1)
3 讨 论
NO是一种自由性质的气体，为较小的生物活性分子，可自由穿过细胞膜，作用于细胞内的靶分子。机体内NO过量的生成可直接抑制有关酶的活性,可与超氧化物歧化物结合导致细胞的损伤[6，7 ]。有研究表明NO在脑缺血性损伤发病中起重要作用，缺血后数分钟NO含量明显增高，之后缓慢下降，于再灌注期NO再次升高[5]。NOS是NO合成中的关健调节因素，体内NO的含量及生物学作用完全依赖于NOS的活性。NOS活性的升高伴随着NO含量的增加。在3种NOS中nNOS和eNOS在缺血再灌注早期发挥作用，iNOS在缺血再灌注晚期发挥作用，参与神经损伤。NOS活性升高和NO含量增加的机制可能为：脑缺血后神经元受损，细胞膜去极化过程增强，突触前谷氨酸等兴奋性氨基酸生成大量增加，使细胞外谷氨酸浓度升高，激活N?甲基?D?天门冬氨酸(NMDA)受体，NMDA受体激活后使突触后Ca2+内流增加，激活NOS活性，促进NO的生成;再次，脑缺血后ATP大量消耗，使能量代谢障碍及cAMP依赖性蛋白激酶活性下降，使NOS脱磷酸化，NOS的活性增强。本实验的结果表明，大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后，脑组织中iNOS活性显著增加，说明iNOS参与了脑缺血再灌注损伤的发病机制，给予麦芽醇后，iNOS活性明显下降。我们以往的研究表明麦芽醇对脑缺血再灌注损伤有保护作用，其机制与清除自由基、抑制凋亡因子和神经元凋亡有关，并且对神经型NOS(eNOS)也有调节作用。本研究结果表明麦芽醇对脑缺血再灌注损伤后iNOS具有调节作用，由此，我们推测麦芽醇通过对NOS活性和NO含量进行调节从而发挥脑缺血再灌注损伤的保护作用，详细机制有待进一步研究。
【】
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