成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养

【摘要】  目的  探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养方法。方法　取成年Wistar大鼠的后肢肌肉,利用组织块法培养成肌细胞。并对培养细胞进行形态学研究和细胞鉴定。结果　采用组织块培养成肌细胞的密度可达118/ml, 成肌细胞的分化鉴定显示94%以上的细胞呈骨骼肌特异的肌细胞。结论　利用组织块法成功培养成年大鼠原代骨骼肌成肌细胞,该方法实用性强,所得成肌细胞纯度高,为深入研究心力衰竭骨骼肌成肌细胞自体移植奠定了基础。
【关键词】  骨骼肌成肌细胞  原代培养  大鼠  成年
【Abstract】 Objective： To explorean experimental method for primary culture of adult rat skeletalmuscle sarcoblast Methods: Muscle of posterior limb from wistar rat were cultured by tissue culture method. The cells were counted and observed by light microscopy combined with identification. Results:The number of skeletalmuscle sarcoblast 118per millilitre. skeletalmuscle sarcoblast cell differentiation accredit showed that over 94% cells were stained positive for myogenin.Conclusions:　Tissue culture method conveniently permits the purification and Proliferation of myoblast. These esults provide the basis for future studies to assess the ability of the cells to repair heart failure.
【Key words】skeletalmuscle sarcoblast  primaryculture  rat  adult
        心肌细胞是终末化组织，不能再生。心梗后坏死的心肌必然被纤维组织代替。当前内外科的均不能修复及逆转已经坏死的心肌，坏死的部分经过心脏重构，最终为缺血性心力衰竭，其5年生存率不到50％，缺血性心衰的病理生理有多种因素参与，但丧失心肌细胞是主要原因。如何攻克缺血性心力衰竭已成为本世纪的最大课题。目前治疗终末期心力衰竭的唯一有效方法是心脏移植，而心脏移植受到器官来源、经费、免疫排斥反应方面的限制，能够接受心脏移植手术的病人目前每年只能达到近百例，目前细胞移植已经成为治疗缺血性心衰最有前景的方法之一。心肌细胞移植是向心肌梗死疤痕区注入某些肌源性未成熟或未分化的细胞成分，这些细胞在心肌的微环境下能够成熟，向心肌细胞转化，改善心功能。骨骼肌成肌细胞是首先应用于临床试验、并在临床试验中研究最多的移植细胞。越来越多的证据表明，相比较间质干细胞而言，骨骼肌成肌细胞可能是更为理想的干细胞移植对象，其原因有以下几点：①骨骼肌成肌细胞对缺血、缺氧的环境更为耐受；②骨骼肌成肌细胞可以确定的转化成横纹肌特性的肌细胞；③骨骼肌成肌细胞容易提取、分立、培养和增殖[1,2]。
        1 材料与方法
        选用成年Wistar大鼠购于哈医大实验中心，低糖DMEM培养基、ham，sF-10培养液、低糖DMEM培养基、小牛血清gaba公司产品骨骼肌成肌细胞获取、分离、培养及标记  选用成年Wistar大鼠,麻醉下切取胫前肌1g,研磨肌肉组织,酶解15分钟(胶原酶IA，1.5mg/ml,37'C)，继之放PBS—EDTA(0.25％)中37℃下20分钟，置入100一um细胞过滤器中，过滤后离心,细胞置于F-10培养液中,1％青链霉素(10000单位/ml)，放入细胞培养箱中培养(37℃,5％co2)。3d换液一次,待细胞长满瓶底即可传代。
        2 结果
        成肌细胞的培养　采用组织块培养法贴块2d后即可见有细胞从肌小粒边缘爬出,细胞呈梭形,胞浆透明。1周后细胞可长满瓶底的60%～70%,其数目可达105,此时细胞可呈多角形,充分伸展,部分细胞密集区可见细胞呈向心性生长,相互间排列整 齐,类似骨骼肌的纵切面。
        成肌细胞的分化鉴定　换用诱导分化液后细胞可在3d内分化,融合交织形成肌纤维,可观察到收缩现象;并且部分细胞分化形成细长的肌管,高倍镜下可见多个核及核分裂象。这些现象为成肌细胞所特有,可以作为简便的鉴定方法。
        3 讨论
        目前最大的动物和临床研究资料是使用骨骼肌成肌细胞，它存在于成人骨骼肌中，在创伤后可增生，重构肌肉。近10年来有诸多关于在鼠与绵羊将骨骼肌成肌细胞成功移植到心肌的研究报告。它们显示可将自体骨骼肌成肌细胞注射到受损心肌内，形成横纹肌。2000年6月15日成肌细胞移植首先应用于临床[3]。1期临床试验的成功证实了此方法的可行性[4]。然而在试验中唯一不利的事件是移植后心律失常的发生。然而在试验中唯一不利的事件是移植后心律失常的发生，在早期（术后3周内）发生在4例患者中，除一例患者耐受。发生原因可能由于骨骼肌成肌细胞不能形成心肌细胞间的间隙连结，它们不能与心肌本身的细胞等速进行电传导，从而易导致恶性心律失常。但FormigliL等的研究表明，骨骼肌成肌细胞缺血心肌移植后骨骼肌成肌细胞可以和心肌细胞之间形成通道连接，松弛素可以增强这种细胞间连接[5]。
        我们采用组织块法成功培养了成年大鼠的成肌细胞,组织块培养法实用、可行,耗材少、成本低,可获得含量超过90%以上的成肌细胞。采用此方法培养成肌细胞,短期内获得大量成肌细胞成为可能,也为我们进一步开展成肌细胞心肌内自体移植创造了条件。我们的研究结果意图在于贴近临床,为心力衰竭患者采用自体成肌细胞提供实验依据,也为心脏疾病的基因治疗奠定基础。
参 考 文 献
[1] Conconi MT，De Coppi P，Bellini S。Homologous mustle ace]1Ular matriK seeded withautologous myoblasts aS a tissue—engineering approach to abdominal wall—defectrepair．Biomaterials．2005 May：26(15)：2567—74．
[2] Rigatelli G，Rossini K，Vindigni V．New perspectives in the treatment Of damagedmyocardium using autologous skeleta.
[3] Menasche P,Hagege AA,Scorsin M,et al.Myoblast transplantation for heat failure.lancet.2001,357:279-280.
[4] Menasche P,Hagege AA,Vilquin JT,et,al.Autologous skeletal myoblast transplantation ror severe post-infarction left ventricular dysfunction.J Am Coll Cardiol,2003,41;1078-83
[5] Formigli  L  Francini F，Tani A. Morphofunctional integration between skeletal myoblastsandadultcardiomyocytes incoculture iS favoredbydirect Cell一Cell contactSandrelaK lntreatment．Am  J Physiol Cell Physi01．2005 Apr：288(4)：C795—804．