自由基、细胞凋亡与衰老关系的研究进展

　　衰老(aging)是生命运动的过程，存在于任何生命体的任何时期，只是不同情况下其速率与程度有所区别。对衰老这一重大课题的了解目前仍限于一些初步实验和学说，其中以氧自由基和细胞凋亡等学说影响较深远。近年来，大量研究证明：自由基尤其是活性氧自由基是参与调节细胞凋亡的重要因素之一，而有人认为衰老细胞的死亡实质上就是细胞凋亡〔1〕。探讨研究自由基、细胞凋亡与衰老的相关性，具有重要的理论及实际意义。

　　1　自由基与细胞凋亡

　　1.1　自由基　自由基及氧衍生自由基是具有未配对的原子、原子团及分子，是参与人体内氧化还原反应最重要最广泛的反应成分。生物体内具有一整套产生和清除自由基的平衡体系，过量产生可引起不同程度的细胞毒性及瞬时的不可逆损伤〔2〕，广泛涉及衰老、退行性疾病、肿瘤等的发生〔3〕；抗氧化防御系统能防止氧及代谢产物对机体的毒性反应，维持其平衡是决定细胞生存状态的重要因素。

　　1.2　细胞凋亡　细胞凋亡是多细胞有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡过程〔4〕。确认细胞凋亡的主要特点：细胞体积变小，染色质浓缩，呈块状致密染色区，DNA分子被特异性DNA内切酶在核小体间切断，核裂解，形成凋亡小体，被具有吞噬能力的细胞清除。凋亡细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳表现为相差180～220 pb大小的梯状图谱。个体的发育与细胞凋亡密切相关，机体的生长发育及衰老均离不开细胞凋亡的调节，多种因素参与了细胞凋亡的调节过程。

　　1.3　自由基影响细胞凋亡　在诸多凋亡的诱因中，体内代谢或外源性因素产生的自由基均被证实可诱导细胞凋亡〔5〕。电离辐射是引起细胞凋亡的重要因素之一，是通过直接辐射水分子产生羟自由基导致细胞内大分子的氧化损伤，使蛋白质氧化、DNA链断裂、细胞膜起苞、脂质氧化等，而这些正是细胞凋亡的特征。但羟自由并不是造成凋亡时DNA电泳区带呈梯状的直接原因〔2〕，它与凋亡初期DNA被切割成碱基片段过程有关。自由基可直接诱导细胞凋亡，Lennon等对4种不同造血细胞HL60、U937、Molt-4和Daudi进行体外培养，发现活性氧自由基(ROS)直接引起细胞凋亡，其机理可能与ROS引起Ca2+内流有关。许多不同的细胞系在暴露于剂量为10～100 mmol/L的过氧化氢时，均可诱导细胞凋亡的发生〔2〕；而在1～10 mmol/L剂量的过氧化氢时，表现有丝分裂原的作用，刺激细胞生长；剂量大于100 mmol/L时，表现细胞毒性作用；达到400 mmol/L时，直接引起细胞坏死。这种不同剂量的过氧化氢与细胞生长状态的相关性，提示自由基定量作用对细胞凋亡的发生有重要影响。

　　一氧化氮(NO)是一种自由基，具有单个未配对电子，化学性质非常活泼，可与分子氧形成氧自由基和过氧化氢。NO已作为巨噬细胞、单核细胞的凋亡诱导剂〔6〕，细胞内源性和外源性NO的增加可导致细胞凋亡，其原因可能是对DNA的直接损伤而导致细胞凋亡。

　　活性氧是一种高度活性的非特异分子，可调节细胞凋亡，介导细胞凋亡，这己被众多学者从多种途径证实。肿瘤坏死因子(TNF)可诱导细胞内氧产生，细胞内表达Mn-SOD能抑制TNF所引起的细胞凋亡。Tory等〔7〕通过特异性抑制PC12神经细胞系中Cu-Zn-SOD的合成试验，证明SOD活力下降可导致细胞凋亡，这种凋亡是ROS诱导的。对HIV感染的研究结果提示，细胞内SOD、过氧化氢酶减少，可能导致细胞凋亡〔8〕。许多抗氧化活性物质可阻止细胞凋亡。Hockenbery等〔9〕发现过度表达谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的小鼠IL-3依赖的FL5、FL12细胞能在缺乏IL-3的情况下存活。另有人发现过度表达Mn-SOD的肿瘤细胞能耐受辐射、抗肿瘤药物所导致的细胞凋亡。活性氧虽可诱导细胞凋亡，但并不是细胞凋亡的必需物质，如将细胞培养在厌氧环境，活性氧不可能产生，但细胞凋亡仍在发生〔10〕。

　　与细胞凋亡密切相关的基因bcl-2被证实可通过调节抗氧化途径阻止一系列氧化应激诱导的细胞凋亡。它可阻止γ射线诱导的细胞凋亡〔8〕，γ射线是通过对水的电离形成活性氧而引起DNA损伤，bcl-2位于细胞内氧自由基产生的细胞器，如线粒体、内质网、核膜等，由此推测bcl-2是通过抑制电离辐射产生的ROS对脂质过氧化作用而发挥其抑制 细胞凋亡的功能。另有人认为，bcl-2抗凋亡作用的可能机制是作为自由基清除剂，如在体内大多数羟集团产生与氧自由基、过氧化氢、Fe2+集中的特异位点上，bcl-2可以在活性氧特异产生部位来调节抗氧化途径〔9〕。

　　如上所述，细胞凋亡过程中有自由基的参与，但自由基调节细胞凋亡的机理尚不清楚，有人提出了两种可能机制〔11〕：①能使细胞凋亡的因子使细胞内过氧化氢(H2O2)水平升高，H2O2再激活Ced-3等死亡基因，使细胞发生程序性死亡。②能引起细胞凋亡的因子先激活Ced-3等死亡基因，从而使细胞内H2O2水平提高，由于H2O2的损伤作用使细胞死亡。

　　2　细胞凋亡与衰老

　　2.1　衰老的生物学研究进展　人们把从胚胎到死亡的整个生命过程中机体发生的一切随时间推移而形成的退行性变化都归属于衰老。而通常所讲的衰老，是指生物体在生命过程中，随年龄增长，在形态结构、生理功能方面出现的一系列慢性、进行性、退化性变化。这些变化导致适应力、储备力日趋下降，这一过程不断发生形成衰老。法国胚胎学家Minot认为衰老是细胞分化的结果；19世纪Weismann的假说认为衰老是一种按程序形成的适应过程中，是演化中发生的；演化论专家们认为衰老是源于选择压力的随龄下降。随着分析方法和技术的提高，许多衰老细胞基因表达的变化被阐明，由此产生遗传程序假说，认为细胞程序对衰老起主动作用并引起特征性形态改变及衰老性生长停滞，认为衰老细胞的死亡实质就是细胞凋亡〔1〕。

　　2.2　细胞凋亡对衰老的影响　细胞凋亡参与机体的许多重要生理、病理过程，但目前人们对细胞凋亡与衰老的机制仍不十分清楚，在研究两者相关性时，其共同的观点是细胞凋亡通过破坏重要的不可替代的细胞对衰老起负面影响，提出细胞凋亡以两种形式对衰老起作用〔12〕：①清除己经受损的和功能障碍的细胞(如肝细胞、成纤维细胞)，被纤维组织替代，继续保持内环境稳定；②清除不能再生的细胞(如神经元、心肌细胞)，它们不能被替代，导致病理改变。通过以上机制，细胞凋亡的结果使体细胞特别是具有重要功能的细胞如脑细胞数量减少，造成其所组成的重要器官如脑皮层的萎缩等老年性进行性病理过程。

　　3　自由基、细胞凋亡与衰老

　　如前所述，自由基与细胞凋亡密切相关。是否可以认为氧自由基通过细胞凋亡是影响衰老进程的重要因素。清除产生氧自由基的酶类，减少自由基产生，有延缓衰老的作用，反之，活性氧升高，或抗氧化剂的减少则导致细胞凋亡，可促进衰老的进程。Rusting〔13〕曾培养出一种寿命几乎两倍于野生型的果蝇，发现这种长寿命的果蝇体内SOD活性很高。适度节制饮食，使人体氧负荷降低，氧自由基产生减少，最低限度的影响DNA碱基交换，单链断裂，使细胞凋亡得以适当抑制，衰老相关变化得以延缓，使很多生理、生化、行为的衰老变化延迟，最终获得寿命延长。

　　脑组织是体内氧负荷最大的器官之一，是与衰老相关性很高的组织。Alzheimer病(AD)是常见的老年病，主要病理改变是脑血管壁β-淀粉样蛋白变性，神经原数量减少，神经纤维缠结。有人认为AD的病理变化是细胞凋亡过盛而导致神经原退行性变〔14〕。Benzi等〔15〕报道了氧自由基在衰老和AD中的重要作用，指出脑组织中含高浓度不饱和脂肪酸、儿茶酚胺和高水平的氧化代谢，是氧自由基最易侵袭的靶器官，而脑内保护性抗氧化酶和非酶性自由基清除剂含量却很低，同时发现AD患者脑的神经纤维缠结中有血红素氧化酶-1、Cu-Zn-SOD，说明氧自由基与神经纤维缠结形成有关，表明氧自由参与了AD的病理过程。推测氧自由基是通过细胞凋亡而加重AD的病理变化。有人证实自由基促进β-淀粉样肽的聚积〔16〕，同样β-淀粉样肽可诱导神经原细胞凋亡〔17〕。详细机制有待探讨。Chen等〔18〕曾经证明细胞早期立即反应基因的表达及产物的活性是有氧化应激控制而且能与神经原内的DNA修复系统相互作用。所以可以推测，β-淀粉样蛋白可诱导氧自由基的产生，氧自由基通过触发细胞早期立即反应基因而引起细胞凋亡。AD与氧化应激密切相关，氧自由基亦可直接引细胞凋亡导致神经原死亡。

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