反相高效液相色谱法测定吸入用异丙托溴铵溶液的含量

               作者：卢来春，张蓉，刘同华，蒋学文

【摘要】  目的: 采用反相高效液相色谱法测定吸入用异丙托溴铵溶液的含量。方法: 色谱柱为 phenomenex?C8 （4.6 mm×250 mm，
5 μm），流动相为乙腈?0.25%庚烷磺酸钠溶液（29∶71）用磷酸调pH值至3.2；检测波长为210 nm；流速为1.0 mL/min；进样量20 μL。结果:异丙托溴铵在12.8～256 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.9995，日间、日内RSD均小于1.5%。结论：本方法准确可靠，可用于吸入用异丙托溴铵溶液的质量控制

【关键词】  异丙托溴铵；含量测定；高效液相色谱法

异丙托溴铵是一种具有抗胆碱能特性的四价铵化合物，可竞争性抑制乙酰胆碱对气道平滑肌的收缩作用。通过抑制细胞内cGMP生成，减少cAMP降解，降低细胞内钙离子浓度，使气道平滑肌松弛，肥大细胞释放炎性介质下降，终止气道扩张，呼吸阻力减小。吸入异丙托溴铵后，作用只限于肺部扩张支气管，而不作用于全身，主要采用气雾吸入给药［1］。吸入用异丙托溴铵溶液在临床上应用较广泛，主要采用压缩雾化吸入或超声雾化吸入给药，常用于预防和儿童支气管哮喘。本文考察了异丙托溴铵含量的HPLC测定方法，为制剂的质量控制提供了方法学依据。

　　1  仪器与材料

    LC?10ATvp高效液相色谱仪（日本岛津公司）；异丙托溴铵对照品（购自浙江优联医药化工有限公司，经精制后色谱峰为单峰）；吸入用异丙托溴铵溶液（爱全乐）购自德国勃林格殷格翰国际公司（批号638066，规格为含异丙托溴铵2 mL∶500 μg）；庚烷磺酸钠为离子对色谱试剂，纯度≥99％，购自上海亿日化工科技有限公司；乙腈为色谱纯；其它试剂为分析纯。

　　2  含量测定

　　2.1  色谱条件

    参照［2?4］，选定试验条件为：C8色谱柱（phenomenex?C8 5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为乙腈?0.25%庚烷磺酸钠溶液（29∶71）用磷酸调pH至3.2；检测波长为210 nm；流速为1.0 mL/min；进样量20 μL。

　　2.2  对照品贮备液的制备

    精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥24 h的异丙托溴铵对照品12.80 mg，精密称定，置10.0 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1.28 mg/mL的异丙托溴铵对照品液，备用。

　　2.3  供试品溶液的制备

    取本品15瓶，合并内容物，混匀，精密量取10 mL，置50 mL量瓶中，加0.001 mol/L盐酸溶液?甲醇（1∶1）稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

　　2.4  系统适应性试验

    取溴化钾适量，用流动相溶液溶解制成溴化钾溶液。精密吸取溴化钾溶液、“2.2”、“2.3”项下溶液适量，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，与异丙托溴铵对照品比较，供试品异丙托溴铵色谱峰分离良好，符合高效液相色谱法的要求，且溴离子不影响本品含量测定。异丙托溴铵的出峰时间约在22 min。

　　2.5  最低检测限和最低定量限

    取异丙托溴铵对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成供试液，按上述色谱条件取10 μL进样。经试验，当进样浓度为0.3 μg/mL时，信噪比为3∶1，即最低检测限为0.3 μg/mL×10 μL=3 ng；当进样浓度为1.1 μg/mL时，信噪比为10∶1，即最低检测限为1.1 μg/mL×10 μL=11 ng。

　　2.6  线性范围考察

    取对照品储备液，分别精密吸取0.1、0.2、0.4、0.8、2.0 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得浓度依次为12.8、25.6、51.2、102.4、256 μg/mL的系列标准溶液。照上述色谱条件，进样20 μL，以样品浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=5900.864C+16415，r=0.9995，线性范围为12.8～
256 μg/mL。

　　2.7  精密度试验

    分别取12.8、51.2、2560 μg/mL三种浓度的对照品溶液，于1 d内分别进样5次及5 d内分别进样5次，分别计算日内、日间RSD。结果见表1。表1  精密度试验结果（略）

　　2.8  样品溶液稳定性试验

    取批号为638066的样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在12 h内每隔3 h进样测定1次，测得RSD为1.30%，表明在12 h内样品溶液稳定性较好。

　　2.9  重复性试验

    取批号为638066的样品，按“2.3”项下方法平行制备5份供试品溶液，分别进样，测得RSD为1.03%，表明该法重复性较好。

　　2.10  回收率试验

    取异丙托溴铵对照品约16 mg、20 mg和24 mg各三份，精密称定，按处方比例加入空白辅料适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定含量，计算回收率，结果见表2。表2  回收率试验结果（略）

　　2.11  样品含量测定

    取批号为638066样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，样品含量测定结果为98.8%。

　　3  讨论

    异丙托溴铵为溴化季铵盐，在溶液状态下，其溴以离子形式存在［3］，在210 nm处有一定紫外吸收。为验证该测定方法溴离子的存在不影响异丙托溴铵的含量测定，故选定溴化钾进行了试验。试验表明，采用该测定方法，溴离子不干扰异丙托溴铵的含量测定。流动相采用等度洗脱系统，用二极管阵列检测器测定异丙托溴铵对照品的峰纯度大于99.8%，表明主峰为单一峰，在210～400 nm波长扫描，未漏检杂质峰。异丙托溴铵浓度在12.8～256.0 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。
    本方法灵敏度高，方法准确，重复性好，且操作简单，可用于吸入用异丙托溴铵溶液的质量控制。

【】
  　　［1］付笑飞. 异丙托溴铵的药理基础及临床应用现状［J］.中华医学杂志, 2005, 29(02): 139?140.

　　［2］Peter JS, Robert WT, Cynthia SG, et al. The separation of ipratropium bromide and its related compounds ［J］. J of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1998，17: 841?849.

　　［3］汪 洁. 吸入液中异丙托溴铵和苯扎氯铵的HPLC测定［J］.医药杂志, 1996, 27(09): 413?414.

　　［4］谭生建, 张启明, 刘 刚, 等. 高效液相色谱法测定复方异维倍克气雾剂中异丙托溴铵和盐酸克仑特罗的含量［J］.药物分析杂志, 2005, 25(09): 1070?1072.