血氨浓度测定方法学研究
【摘要】 目的：建立紫外分光光度法检测血液中的氨浓度的方法，为临床肝性昏迷、肝性脑病、重型肝病、尿毒症等代谢障碍疾病的诊断提供。方法：血液离体后，立即加入定量过量的钨酸钠及硫酸溶液，使蛋白沉淀的同时，血液中的氨与硫酸形成硫酸铵而存留于血滤液中，再以酚-次氯酸钠显色后于波长630 nm处测定光密度OD值（以空白校正）。结果：血氨在20～60 μmol/L范围内浓度与OD之间呈良好的线性。结论：此方法快速、简便，适合临床检测血氨的浓度。
【关键词】 血氨；方法学；光密度
正常人体内游离血氨（blood ammonia，BA）含量极低（正常值20～60 μmol/L）［1］，其主要来源于体内蛋白质在代谢过程中产生的氨基酸，以及经脱氨作用分解而来的内源性氨，正常情况这种氨可形成酰胺及合成其他含氮化合物而不断地被转化；另一来源是蛋白质类食物在肠道内经细菌分解而成的外源性氨，正常情况下此氨经门静脉进入肝脏被合成为脲，经肾脏排出体外。然而在发生代谢障碍性疾病，如肝性昏迷、肝性脑病、重型肝炎、尿毒症等由于氨不能正常代谢排出体外而引起BA升高。肝功能极度衰竭或血液不能正常地流经肝脏转换等严重肝脏疾病，氨不能从循环中及时清除均可使血氨增高［1］。高BA有神经毒性，BA的测定对于肝硬化门脉高压、肝昏迷、Reve’s综合征及儿科的一些先天性代谢紊乱等病的诊断、观察和预后判断有着重要意义［2］。BA的测定方法有微量扩散法、比色法、离子交换法、氨电极法、酶法等。笔者在结合本实验室现有条件，参考国内外有关建立快速、准确的检测BA方法，为临床该类疾病的诊断、提供参考。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
天平 COBS?120型（朝鲜COBS公司），紫外分光光度仪HP8453（美国惠普），离心沉淀器800型（上海手术仪器厂），YKH?I型液体快速混匀器（江西医疗器械厂），DHW?420三用电热恒温水箱（北京东霞仪器厂）。
1.2 试药
钨酸钠（天津市大茂化学试剂厂，批号030906），硫酸铵（重庆北碚化学试剂厂，批号050329），亚硝基铁氰化钠（上海三爱思试剂公司，批号20020204），苯酚（重庆北碚化学试剂厂，批号：20000924），氢氧化钠（重庆川江化学试剂厂，批号20000312），次氯酸钠（重庆川东化工集团化学试剂厂，批号20040904），硫酸铵（重庆北碚化学试剂厂，批号050329），硫酸（重庆川江化学试剂厂，批号20000105），所用试药均为分析纯，水为新制无氨蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 储备溶液的配制［2］
无氨水的制备：参照文献［3］取重蒸水1 000 mL，加稀硫酸1 mL与高锰酸钾试液1 mL，蒸馏即得备用。
酚显色剂：精取亚硝基铁氰化钠25.00 mg，与适量苯酚混合后加无氨水至100 mL,过滤即得。
碱性次氯酸钠溶液：精取250 mg次氯酸钠，氢氧化钠2 500 mg，溶于100 mL无氨水中即得。
0.5 mol/L硫酸溶液、5 mmol/L硫酸铵溶液参照文献方法［3］配制。
2.2 标准溶液的配制
分别精取“2.1”项的硫酸铵储备液20、200、500、1 000、1 500、2 000、4 000 μL置于50 mL容量瓶，立即加无氨水至刻度即得10、20、50、100、150、200、400 μmol/L的硫酸铵系列标准溶液。
2.3 标准曲线的制备
取“2.2”项的硫酸铵系列标准溶液各1 mL，分别加入10 %的钨酸钠溶液、0.5 mol/L硫酸溶液各0.5 mL，涡旋震荡1 min，4 000 r/min离心5 min，分取上清液1 mL，依次加入酚显色剂和碱性次氯酸钠溶液各1 mL，涡旋1 min后置37 ℃水浴20 min，以空白管校正后于630 nm处测定OD值；将所测得的吸收度OD值对浓度进行线性回归处理得回归方程：OD=0.0017C+0.23，相关系数r=0.9964，根据(NH4)2SO4与游离氨的定量关系，即得游离氨浓度在5～200μmol/L的定量线性范围（见图1）。
2.4 临床样本的测定
参考国内外有关文献，经优化后测定BA的方法为：离体血液立即加入过量定量的10%钨酸钠及0.5 mol/L硫酸溶液，使蛋白沉淀的同时，血液中的氨与硫酸形成硫酸铵而存留于血滤液中，再以酚?次氯酸钠显色剂显色后于波长630 nm处测定OD值，即可定量测定BA。
2.5 方法的回收试验
按“2.2”项的方法分别配制高、中、低（400、200、40 μmol/L）的硫酸铵标准溶液适量，各取1mL分别加入1 mL无氨正常血浆，混匀后精密量取1 mL按2.4项下的方法分别精密加入0.5 mL 10 %钨酸钠和0.5 mol/L硫酸溶液各0.5 mL，以下按准曲线项下相应的方法处理并分别测定其OD值，将测得的OD值代入标准曲线测得量与回收率，结果见表1。表1 血氨回收试验（略）
2.6 精密度试验
配制低、中、高（25、50、75 μmol/L）3个浓度含无氨正常血浆的硫酸铵溶液各3份，日内4 ℃冷藏保存，每间隔1 h按2.3标准曲线项下的方法测定1次，连续测定5次。另取相同样品?18 ℃冷冻保存，每日测定1次，连续测定5日。所得OD值代入标准曲线方程计算得游离氨浓度，结果见表2。表2 血氨精密度试验（略）
2.7 稳定性试验
取硫酸铵溶液适量配制成75 μmol/L含无氨正常血浆的硫酸铵溶液，分别置于4 ℃冰水浴和?18 ℃条件下储藏保存，每次平衡5 min后各取1 mL样品，按“2.6”精密度试验项下的测定方法，4 ℃下保存的标本在1 d内每间隔2 h测定1次，每次平行测定5份，直至14 h共测定8次；?18 ℃条件下保存的标本每天定时测定1次，每次平行测定5份，连续测定7 d，将测得的OD值通过标准曲线方程计算游离氨的实际含量，结果见表3。由表可知新鲜血中游离氨极不稳定，常温和4 ℃冷藏保存均不稳定，宜在2 h内测定，在?18 ℃下保存也宜在24 h内测定。表3 血氨稳定性试验（略）
2.6 临床应用
选择我院近2年来的住院患者，除外肝、胆、肾疾病患者。脑梗塞患者28例，其中男16例，女12例，平均年龄（55.8±10.5）岁；脑溢血患者25例，其中男15例，女10例，平均年龄（60.4±15.4）岁；脑炎患者10例，其中男6例，女4例，平均年龄（39.8±13.5）岁。全部病例均经临床及CT和（或）MRI检查。对照组25例，经检查全部健康正常，其中男13例，女12例，平均年龄（57.2±14.3）岁。全部患者均在昏迷期及恢复期各采取肘静脉血1～2 mL，肝素抗凝，立即用上述方法测定血氨，对照组也同时采血测定血氨。
结果对照组血氨含量为（56.53±29.15）μmol/L，脑梗塞组昏迷期血氨含量为（179.00±108.59）μmol/L，恢复期为（66.89±26.67）μmol/L，昏迷期与对照组经χ2检验差异有统计学意义（χ2=12.68，P<0.05），恢复期与对照组相比差异无统计学意义（χ2=5.42，P>0.05）。脑溢血组昏迷期血氨含量为（146.97±72.41）μmol/L，恢复期为（60.46±24.39）μmol/L，昏迷期与和对照组比较差异有统计学意义（χ2=11.78，P<0.05），恢复期与对照组相比差异无统计学意义（χ2=4.68，P>0.05）。脑炎组昏迷期血氨含量为（197.17±62.10） μmol/L，恢复期为（59.83±39.59）μmol/L，昏迷期与对照组显著增高（χ2=9.72，P<0.05），而恢复期与对照组相比差异亦无统计学意义（χ2=3.95，P>0.05）。
3 讨论
由表3结果表明：标本放置时间越长，其血氨浓度越高，主要原因可能是血液细胞自身代谢或部分微生物代谢后产生氨致使其血氨浓度升高。为保证测定结果的准确应注明标本的采集时间并立即送检，送检标本迅速测定（30 min内），同时进行平行质控监测。病人标本采集后如不能立即测试，应在2～8 ℃冷藏最多3 h测定，?18 ℃冷冻保存最多24 h测定。
正常情况下，体内大部分氨经过尿素循环形成尿素自尿中排出，部分为机体再利用，不会产生蓄积，而在尿素循环障碍疾病时则将出现血氨蓄积，在新生儿当血氨大于150 μmol/L、婴幼儿大于80 μmol/L、成人大于70 μmol/L可确定为高氨血症［4?5］。血氨可干扰脑的能量代谢，脑组织在氨的生成中需消耗某些辅酶、高能磷酸及大量α?酮戊二酸，引起高能磷酸化合物浓度的降低，过量氨还可能抑制丙酮酸脱氢酶活力而影响乙酰CoA的生成和乙酰胆碱的合成，干扰三羧酸循环，氨还可抑制Na+?K+?ATP酶，直接影响钾、钠在神经细胞膜上的正常分布，干扰神经传导活动，当脑组织炎症、缺血、缺氧时就影响了氨的代谢使氨增高。脑缺血后可导致生化代谢方面的变化，影响氨的平衡，脑组织内氨水平增高。有实验表明，大鼠在脑循环中断5 min后，其缺血的皮层氨含量从对照值的0.28 mmol/L升高到1.12 mmol/L。在脑组织内，氨的解毒主要靠α?酮戊二酸的氨化作用以及氨与谷氨酸结合生成谷氨酰胺，但后者的反应需要消耗ATP，在缺血情况下α?酮戊二酸的氨化起主要作用。同时昏迷患者常常禁食，致使液体摄入减少或用脱水剂过量，从而致使血氨显著增高。此外，由于感染、高热等增加机体代谢，也使内源性血氨增高。国外学者Kanamori?K等研究了小鼠体内的氨、谷氨酰胺以及谷氨酰胺合成酶与脑病的关系，表明脑病与氨相关［6］。国内李英杰等［7］测定22例脑梗塞患者的血氨和CSF氨含量，结果表明急性期血氨和CSF氨显著高于对照组（P<0.01）梗塞面积与氨含量明显相关。本文病例监测结果：患者组昏迷期血氨水平显著高于恢复期和对照组（P<0.01），亦表明这一病理，提示对于脑血管病及脑炎患者、昏迷期患者，应注意检查血氨，以了解患者的氨代谢情况。
【】
［1］李影林. 临床医学检验手册［M］. 第1版. 吉林: 吉林技术出版社, 1990: 503.
［2］孔祥云, 徐勉忠. 实用临床医学检验［M］. 第1版. 武汉: 湖北科学技术出版社, 1984: 11?21.
［3］中华人民共和国药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)［S］. 2005年版. 2005, 附录: 134.
［4］Nyhan WL, Ozand PT. Atlas of metabolic diseases［M］. London: Chapman Hill Medical, 1998: 167?187.
［5］顾学范, 叶 军. 新生儿疾病筛查［M］. 第1版. 上海: 上海科学技术文献出版社, 2003: 227?233.
［6］Kanamori?K, Ross BD, Chung JC, et a1. Severity of hyperam monemic encephalopathy correlates with brain amm onia level and saturation of glutam ine synthetase in vivo ［J］. Neurochem, 1996, 67: 1584?1590.
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