毛细管电泳法测定银黄胶囊及银黄颗粒中黄芩苷和绿原酸的含量

                        作者：宋粉云 龚红全 林琳 彭子彦

【摘要】  目的 建立同时测定银黄胶囊及银黄颗粒中黄芩苷和绿原酸含量的方法。方法 采用毛细管电泳法，电泳条件：未涂层弹性融硅石英毛细管柱（55 cm×75 μm ID，有效长度47 cm）；以40 mmol/L 硼砂溶液（pH9.30）为运行缓冲液；分离电压15 kV；重力进样5 s（高度15 cm）；检测波长310 nm。结果 以对硝基苯甲酸为内标，黄芩苷、绿原酸的线性范围分别为20.2～101.0 μg/mL（r=0?9981），5.15～25.75 μg/mL（r=0.9991）。银黄胶囊中黄芩苷、绿原酸的平均回收率分别为105.0%、97.2%，银黄颗粒中黄芩苷、绿原酸的平均回收率分别为101.3%、96.6%。结论 该法简便、快速、准确可靠，可用于银黄胶囊及银黄颗粒的质量控制。

【关键词】  毛细管电泳；银黄胶囊；银黄颗粒；黄芩苷；绿原酸

　　Abstract:Objective To establish a method for the content determination of baicalin and chlorogenic acid in Yinhuang capsules and Yinhuang granules. Methods  Samples were analyzed on a uncoated fused silica capillary (55 cm×75 μm, 47 cm） using 40 mmol/L Na2B4O7（pH 9.30）as running buffer. The voltage was 15 kV. The detection wavelength was 310 nm. Results The method was validated over linear ranges of 20.2~101  μg/mL（r=0.9981）for baicalin and 5.15~25.75 μg/mL（r=0.9991）for chlorogenic acid.  The average recoveries of baicalin and chlorogenic acid in Yinhuang capsules were　105.0%  and 97.2%，respectively. The average recoveries of baicalin and chlorogenic acid in Yinhuang granules were　101.3%  and 96.6%，respectively. Conclusion This technique provides a sensitive, rapid, reproducible and inexpensive assay suitable for quantitative determination of baicalin and chlorogenic acid in Yinhuang capsules and Yinhuang granules.

　　Key words:capillary electrophoresis；Yinhuang capsules；Yinhuang granules；baicalin；chlorogenic acid

　　银黄胶囊与银黄颗粒是由金银花提取物与黄芩提取物制成的中药成方制剂，具有清热、解毒之功效。临床用于急慢性扁桃体炎，急慢性咽喉炎，上呼吸道感染。产品现行标准［1，2］只收载了黄芩苷的HPLC法含量测定，［3-8］报道采用HPLC法测定银黄胶囊或银黄颗粒中黄芩苷、绿原酸含量，但高效毛细管电泳法（HPCE）对银黄胶囊及银黄颗粒的质量控制研究未见文献报道。本文结果表明，HPCE法具有分离效果好、快速、简便等优点，可用于银黄制剂的质量控制。

　　1  仪器与试药　　

　　CL1030型高效毛细管电泳仪（北京彩陆仪器有限公司），德国KNAUER K?2501紫外?可见检测器，HW?2000色谱工作站2.17版（南京千谱软件有限公司）。ORION MODEL 828型pH计（美国）。DL?360超声波清洗器（宁波石浦海天仪器厂），工作频率(4.5±0.05) kHz，输出功率240 W。未涂层弹性融硅石英毛细管柱（75 μm ID，总长55 cm，有效长度 47 cm，河北锐年永沣色谱器件有限公司）。　　

　　黄芩苷对照品（药品生物制品检定所，批号：110715?200514）；绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110753?200413）；银黄胶囊（中山市中智制药有限公司，每粒0.3 g）；银黄颗粒（中山市中智制药有限公司，每包4 g）；硼砂、对硝基苯甲酸、NaOH、甲醇等均为分析纯，水为二次蒸馏水。

　　2  实验部分

　　2.1  溶液的制备

　　2.1.1  内标溶液精密称取对硝基苯甲酸一定量，加甲醇制成300 μg/mL的内标贮备液。

　　2.1.2  对照品溶液广东药学院学报，2007，23(3)第3期  宋粉云，等.毛细管电泳法测定银黄胶囊及银黄颗粒中黄芩苷和绿原酸的含量精密称取黄芩苷对照品20.2 mg，置100 mL量瓶中，加75%（体积分数）甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（质量浓度为202 μg/mL）；精密称取绿原酸对照品10.3 mg置100 mL量瓶中，加50%（体积分数）甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（质量浓度为103 μg/mL）。

　　2.1.3  供试品溶液的制备  　　银黄胶囊：取本品20粒，精密称定重量，倾出内容物，将囊壳拭净，精密称定囊壳重量，求得平均装量。取混匀的内容物约0.5 g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入50%（体积分数）甲醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，称重，用50%（体积分数）甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2 mL，置25 mL量瓶中，精密加入内标贮备液5 mL，加50%（体积分数）的甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。　　

　　银黄颗粒：取银黄颗粒，研碎，取约1 g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入50%（体积分数）甲醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，称重，用50%（体积分数）甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2 mL，置25 mL量瓶中，精密加入内标贮备液5 mL，加50%（体积分数）的甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

　　2.2  电泳条件　　未涂层弹性融硅石英毛细管柱（55 cm×75 μm ID），有效长度47 cm；以40 mmol/L 硼砂溶液（pH 9?30）为运行缓冲液；分离电压15 kV；重力进样5 s（高度15 cm）；检测波长310 nm；温度25 ℃，湿度小于70%。毛细管柱在使用前依次用0.1 mol/L NaOH溶液、水、运行缓冲液各冲洗约5 min，样品分析间隔用运行缓冲液平衡2 min。在此条件下，对照品、样品色谱图如图1所示。

　　2.3  标准曲线制备分别吸取一定量的黄芩苷、绿原酸、对硝基苯甲酸对照品贮备液，加50%（体积分数）甲醇稀释成含黄芩苷质量浓度为20.2、40.4、60.6、80.8、101.0 μg/mL，绿原酸质量浓度为5.15、10.3、15.45、20.6、25.75 μg/mL与内标溶液质量浓度为60 μg/mL的溶液。依次重力进样5 s，每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值（A）为纵坐标，对照品溶液浓度（ρ）为横坐标进行线性回归，分别得回归方程：A黄芩苷=0.030 3ρ-0.221 0（r=0.998 1）；A绿原酸=0.024 3ρ-0.017 0（r=0.999 1）。表明黄芩苷质量浓度在20.2～101.0 μg/mL、绿原酸质量浓度在5.15～25.75 μg/mL与峰面积的线性关系良好。

　　1.黄芩苷； 2.绿原酸；  3.内标物　A.对照品； B.银黄胶囊； C.银黄颗粒

　　图1  对照品、样品的毛细管电泳色谱图（略）

　　Fig.1  Chromatograms of standard  and sample

　　2.4  精密度试验取质量浓度分别为60.6、15.45 μg/mL的黄芩苷与绿原酸对照品溶液，重力进样5 s，连续测5次，记录峰面积并RSD。结果：黄芩苷的RSD=1?42%，绿原酸的RSD=1?56%，表明仪器精密度良好。

　　2.5  稳定性试验取供试品溶液在0、2、4、6、8、10、12 h，分别重力进样5 s，记录峰面积。结果：银黄胶囊（批号：20050906）黄芩苷的RSD=1.98%，绿原酸的RSD=2.73%，表明供试品溶液在12 h内稳定；银黄颗粒（批号：20060918）黄芩苷的RSD=1.75%，绿原酸的RSD=3?03%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

　　2.6  重复性试验分别取银黄胶囊（批号：20050906）或银黄颗粒（批号：20060918）样品6份，按“2.1.3”项下方法提取、测定。结果：银黄胶囊黄芩苷的平均含量为61?82 mg/g，RSD=1.60%（n=6），绿原酸的平均含量为11.82 mg/g，RSD=2.24%（n=6）；银黄颗粒黄芩苷的平均含量为32.04 mg/g，RSD=2.39%（n=6），绿原酸的平均含量为5.72 mg/g，RSD=2.19%（n=6）。表明分析方法精密度良好。

　　2.7  加样回收试验  精密称取银黄胶囊（批号：20050906）或银黄颗粒（批号：20060918）样品各6份，加入相应量的黄芩苷或绿原酸对照品，按“2.1.3”项下方法处理并测定，回收率，结果：银黄胶囊黄芩苷及绿原酸的平均回收率分别为105.0%（RSD=2.42%），97?2%（RSD=1.45%）；银黄颗粒黄芩苷及绿原酸的平均回收率分别为101.3%（RSD=1.73%），96.6%（RSD=2.85%）。结果表明方法准确、可靠。

　　2.8  样品测定 取银黄胶囊或银黄颗粒样品各3批，按“2.1?3”项下方法处理后测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中黄芩苷与绿原酸的含量，结果见表1。

　　表1  样品测定结果（略）

　　Tab.1  Results of sample detection (n=3)

　　3  讨论

　　3.1  检测波长的选择实验发现黄芩苷在278 nm处有最大吸收，绿原酸在315 nm处有最大吸收，考虑到样品中绿原酸的量大大低于黄芩苷，故参照［9］选择310 nm作为检测波长。

　　3.2  内标物的选择    为克服毛细管电泳重现性差的缺点，本文采用内标法定量。曾选用在310 nm处有吸收的苯甲酸钠、对氨基苯甲酸、对硝基苯甲酸为内标物，结果：苯甲酸钠在体系中不出峰；对氨基苯甲酸峰灵敏度低、且保留时间长；对硝基苯甲酸峰型好，出峰时间与黄芩苷、绿原酸接近，在样品中无干扰，故选做内标物。

　　3.3  电泳条件的选择　　银黄制剂中黄芩苷、绿原酸的含量测定，主要采用毛细管区带电泳，采用硼砂溶液为缓冲液［9,10］，因为黄芩苷、绿原酸极性较强，容易离子化，在硼砂溶液中，黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子［11］，加大离子化。本文亦选择硼砂溶液为运行缓冲液。　　

　　分别在pH7.0～10.0、10～50 mmol/L缓冲液浓度范围和9～24 kV工作电压范围内研究了缓冲溶液pH和浓度以及工作电压对分离的影响。在所研究的pH7.0～9.5范围内随pH增加，3种物质迁移时间整体上增加，分离度都符合要求；当pH≥9.5时黄芩苷峰型不好或不出峰，考虑分析时间和分离度两方面影响，选择pH9.30作为最佳运行缓冲液。当硼砂溶液浓度小于30 mmol/L时，绿原酸和内标对硝基苯甲酸分不开；当硼砂溶液浓度大于50 mmol/L时，电流太大，焦耳热严重，且各物质保留时间太长，因此选择40 mmol/L作为最佳缓冲溶液浓度。随工作电压的提高，分离度下降，根据电压与电流的线性关系，最佳电压为18 kV，综合灵敏度、分离度和焦耳热，选择15 kV作为最佳工作电压。

【文献】
  　　［1］ YBZ13372004.国家食品药品监督管理局标准（试行）［S］.

　　［2］ YBZ04942005.国家食品药品监督管理局标准（试行）［S］.

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