胡桃醌对人肝癌BEL?7402细胞增殖和膜流动性的影响

                    作者：陈丽 那顺巴雅尔 张建 于娟 顾为望

【摘要】  目的：研究胡桃醌诱导人肝癌BEL?7402细胞凋亡及其作用机制。方法：采用MTT法测定细胞生长抑制率，通过流式细胞仪观察凋亡细胞，采用荧光偏振技术离体动态地检测30 min内胡桃醌对BEL?7402细胞各向异性r、荧光偏振度P和微粘度η的影响，分析细胞膜流动性的改变。结果：各浓度的胡桃醌均可抑制人肝癌BEL?7402细胞的生长，诱导其凋亡，IC50为13.78μM。不同浓度胡桃醌均可引起BEL?7402细胞膜的r、P和η值显著性降低（P<0.05），尤其在前1 min内r、P、η值下降迅速，1min后各指标下降的趋势渐渐平缓。结论：胡桃醌能显著增加BEL?7402细胞的膜流动性，促进其本身进入细胞内部，抑制细胞的增殖，诱导细胞凋亡。

【关键词】  胡桃醌； BEL?7402； 细胞凋亡； 膜流动性

胡桃醌（Juglone），又名5?羟基?1，4?萘醌，分子式C10H6O3。存在于胡桃科植物胡桃及其同属植物黑核桃的未成熟的外果皮(青皮)、树枝和树皮中，是其主要的毒性物质 ［1，2］。胡桃醌为棕红色结晶，其熔点155℃，微溶于水，遇碱呈紫红色,有升华性，其化学结构清楚（图1）。国外曾有研究者对胡桃醌的抗肿瘤活性做过部分研究，但未见用于临床［3～5］。民间胡桃皮作为抗癌验方，渊源流长，作为胡桃青皮的主要成分胡桃醌的抗癌活性国内亦有报道。研究表明胡桃醌还有抗真菌、抗衣原体或HIV病毒、降血糖和杀虫等生物活性，越来越受到人们的重视［6～9］。胡桃醌可以直接抑制体外培养肿瘤细胞的增殖，其作用与药物浓度和作用时间有依赖关系，有希望成为新的化疗药物。但目前关于胡桃醌诱导肿瘤细胞凋亡的细胞信号调控机制尚不明确,已有报道的结论不甚一致。另外，由于细胞膜不仅与细胞的生长调控过程、免疫反应和信息传递等基本功能密切相关，而细胞表面成分的改变又与肿瘤细胞的侵袭、转移能力密切相关因此，本研究采用人肝癌BEL?7402细胞系为模型，在考察胡桃醌对BEL?7402细胞增殖影响的基础上，在诱导细胞分化的过程中观察胡桃醌对肿瘤细胞膜的影响，探讨其抗肿瘤作用的机制。

    1  材料与方法

    1.1  试剂与仪器

    胡桃醌：购自sigma，Lot：07605DH。精密称取3.5mg胡桃醌，溶于100μLDMSO中，再用PBS稀释成终浓度为20mM的胡桃醌母液，-20℃保存备用。新生牛血清（FBS）：购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，Lot：TBD41HX。使用前置于56℃水浴中灭活30min，-20℃保存备用。青霉素/链霉素液：购自TBD，Lot：20080318。RPMI 1640培养基：购自海克隆生物化学制品有限公司，Lot：NSG0058，使用前每500ml培养基分别加入10%的FBS，5.5ml青霉素/链霉素液，配制成完全培养基，4℃保存。胰蛋白酶/EDTA消化液：购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，Lot：TE2004Y。二甲基亚砜（DMSO）：购自sigma，Lot：D5879，常温避光保存。1，6?二苯基?1，3，5?己三烯(DPH)购自sigma公司，Lot：076K3674。Flou?3/AM购自Biotium，InC，Lot：6F0221。其余试剂为国产分析纯。MTT：购自Sigma，Lot：M2128，用PBS配成5mg/ml工作液，44℃避光保存。

    YG?875B超净工作台，上海医疗器械厂。CO2细胞培养箱为Thermo公司，多光谱微孔板阅读器Version 5为美国Mecular Devices Corporation公司，FACSCalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司。

    1.2  细胞培养与处理

    BEL?7402细胞，广东药学院寄生虫教研室惠赠。细胞置于RPMI 1640完全培养基中，在37℃、体积分数为5% CO2，95％湿度培养箱中培养。细胞单层贴壁生长，每3天更换1次培养基，细胞每周按1：3传代。

    1.3  胡桃醌对BEL?7402细胞株生长的影响

    取对数生长期的BEL?7402细胞株，用含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度为1×105/mL细胞，体积为 200μL，铺96孔培养板，复孔8孔，体外培养24h 后更换为含系列浓度的胡桃醌培养液（终浓度分别为100、50、25、12.5及6.25μM），设立正常对照组和溶剂对照组（1‰DMSO），体外培养48 h后以 MTT法测定OD值，实验重复3次，依下列公式胡桃醌对BEL?7402细胞株的抑制率：

    抑制率(%) =（1-试验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

    1.4  流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率

    取BEL?7402细胞悬液，调整细胞数至1×106/mL ，1000 rpm，离心5min，PBS洗2遍，70%乙醇4℃固定24 h，去除乙醇固定液，PBS清洗，加碘化丙啶(propidiumlodide，PI)染液(含PI 20μg/mL，RnaseA 0.25 mg/mL)0.5mL）。4℃避光染色30 min以上，400目网过滤后上流式细胞仪检测［10］。

    1.5  胡桃醌对BEL?7402膜流动性的影响

    1.5.1  DPH荧光探剂负载液的配制  将0.464 mgDPH溶于1 mL四氢呋喃中，得到浓度为2 mM的储备液，避光保存于-20℃冰箱。用前在室温下融化，添加Hanks液稀释成终浓度为2μM的DPH荧光探剂负载液。

    1.5.2  DPI荧光探剂的负载  待BEL?7402细胞生长至80％融合后，用0.25%胰蛋白酶溶液消化1～2 min，待细胞质回缩、胞体趋于变圆、细胞间缝隙增大时，然后加入完全培养基终止消化并收集细胞，调整细胞数为2×107/mL，离心(1000rpm，10 min)，去上清，沉淀细胞加入1.5 mL的DPH负载液，吹打成细胞悬液，避光37℃孵育30min，2000rpm离心5min，弃去上清，沉淀重悬于Hanks液中待测。

    1.5.3  荧光偏振法检测膜流动性  实验分为空白对照组、溶剂对照组和不同浓度胡桃醌给药组。待多光谱微孔阅读器稳定后，分别加入反应终浓度为400、200、100、50、25、12.5、6.25μM 的胡桃醌，空白对照组加入同体积Hanks液，溶剂对照组加入同体积2‰DMSO。用多光谱微孔板阅读器测定荧光强度，测定条件：激发波长362nm，发射波长432nm，激发狭缝10nm，发射狭缝10nm，温度25±0.5 ℃。BEL?7402细胞膜流动性用各向异性r、荧光偏振度P和微粘度η表示。r、P、η越小，膜流动性越大，反之，膜流动性越小。计算公式如下(G为仪器检测偏振时的校正因子)：

    G=IHVIHH    P=IVV-GIVHIVV-GIMVH    η=2P0.46-P

    其中I为起偏器和检偏器光轴均在垂直方向时的荧光强度；IHV为起偏器光轴在垂直方向检偏器光轴在水平方向时的荧光强度；IHH为起偏器光轴和检偏器光轴均在水平方向的荧光强度；IVH为起偏器光轴在水平方向检偏器光轴在垂直方向时的荧光强度。

    1.6  统计学处理

    所有结果以 ±s表示，多组间比较采用重复测量的方差分析(ANOVA)进行，应用SPSS 13.0统计软件处理，检验水平为α=0.05。

    2  结果

    2.1  胡桃醌对BEL?7402细胞株生长的影响图2  胡桃醌对人肝癌细胞BEL?7402细胞生长的影响

    MTT法测定结果显示（图2），胡桃醌作用于人肝癌细胞BEL?7402 48h后，与正常组比较，溶剂组1‰的DMSO对BEL?7402细胞的生长没有明显的影响，100、50、25、12.5和6.25μM的胡桃醌对BEL?7402细胞均有明显的抑制作用（P<0.05），IC50为13.78μM；细胞的抑制率随着药物浓度的增加显著的增加，呈良好的量效关系。

    2.2  胡桃醌对BEL?7402细胞线粒体膜电势的影响

    由图3、4可知，12.5μM胡桃醌作用于BEL?7402细胞4h后线粒体膜电势降低，提示BEL?7402细胞已经开始凋亡级联反应，该过程发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

    2.3  胡桃醌对BEL?7402细胞周期及细胞凋亡率的影响

    为了进一步了解胡桃醌对癌细胞生长的抑制作用和凋亡的关系，根据MTT结果，我们选择12.5μM的胡桃醌作用于BEL?7402细胞48h，流式细胞仪检测其细胞凋亡率。由图5可以看出，12.5μM胡桃醌作用于BEL?7402细胞48h后流式细胞仪检测出现亚二倍体峰，细胞凋亡率为（51.99±4.90）%。由表1可知，与正常对照组相比，溶剂对照组对BEL?7402细胞增殖周期无影响，而12.5μM胡桃醌作用于BEL?7402后，细胞生长明显受限，G0/G1期和S期细胞比例减少，而G2/M期细胞增多，发生G2/M期阻滞。表1  胡桃醌作用于BEL?7402细胞增殖周期的影响

    2.4  胡桃醌对BEL?7402细胞膜流动性的影响表2  胡桃醌对BEL?7402细胞各向异性r的影响表3  胡桃醌对BEL?7402细胞微粘度η的影响表4  胡桃醌对BEL?7402细胞荧光偏振度P的影从表2～4和图6中可以看出，空白对照组各向异性r、荧光偏振度P和微粘度η随时间延长而无明显变化，膜流动性无明显变化(P>0.05)；与空白对照组和加入溶剂前比较，溶剂对照组加入1‰DMSO后随时间延长r、P、η均无明显变化(P>0.05)，但胡桃醌各组从400μM组起即可引起细胞膜的各向异性r、荧光偏振度P和微粘度η的显著性变化，尤其在前1min内r、P、η值下降迅速；在1 min时，7个剂量组的各向异性r分别降低了34.8%、28.2%、12.7%、10.6%、17.0%、3.7%、22.0%；荧光偏振度P分别降低了34.8%、28.2%、12.7%、10.3%、18.1%、3.7%、22%；微粘度η分别降低了46.3%、38.2%、17.8%、15.4%、21.87%、6.12%、27.47%。在1min后各指标下降的趋势渐渐平缓。在各时间点时，胡桃醌组与空白对照组和加入胡桃醌前比较，r、P、η显著降低。 图6  胡桃醌对BEL?7402细胞各向异性r的影响

    3  讨论

    3.1  胡桃醌对BEL?7402细胞增殖的影响

    肿瘤共同的生物学特征是失控性生长，其主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增生过多和凋亡减少，因此抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡已成为肿瘤的重要手段之一［11］。本研究采用MTT法观察了胡桃醌对体外培养人肝癌细胞BEL?7402细胞生长的影响，同时通过流式细胞仪的检测了解细胞线粒体膜电势的变化及其细胞凋亡的情况。结果表明胡桃醌能有效的抑制人肝癌细胞BEL?7402的增殖的作用机制是：在凋亡早期胡桃醌使细胞线粒体膜电势发生改变，G0/G1期和S期细胞比例减少，而G2/M期细胞增多，发生G2/M期阻滞，从而使BEL?7402细胞生长明显受限。

    3.2  胡桃醌对BEL?7402细胞膜流动性的影响

    细胞膜流动性是生物膜最基本的物理性质，生物膜的各项功能如能量转化、物质运输、信息传递等都与膜的流动性密切相关，细胞要发挥正常的生理功能要求膜处于一定的流动状态［10］。研究表明，细胞癌变后，细胞膜流动性会发生的改变，且因瘤细胞来源的不同其变化趋势也不同，但基本上遵循下述：实体瘤细胞膜的流动性比相应的正常细胞低，腹水瘤、白血病等细胞膜流动性较相应正常细胞高［12］。而以细胞膜的组成为结构基础及作用位点的细胞与细胞之间或细胞与基质之间的相互作用又是肿瘤侵袭和转移过程中的重要环节之一。因此细胞膜结构或功能的改变势必影响转移链的多个环节，使肿瘤细胞的转移能力发生改变。

    荧光偏振法是应用最广的测量膜脂流动性的方法，由荧光偏振度P出的微粘度η值反映了脂质的有序程度和脂链摆动的速率。在流体力学中，微粘度η值的倒数被称为流动性。膜脂区无序性越大，脂质分子排列越不整齐，微粘度η值越小，流动性越大，反之，流动性越小［13］。所以，本文采用该法检测胡桃醌对BEL?7402细胞膜流动性的影响。结果表明，胡桃醌组与空白对照组和加入胡桃醌前比较，r、P、η显著降低，提示胡桃醌可以增强BEL?7402细胞的膜流动性。BEL?7402细胞作为实体瘤细胞，其膜流动性较正常细胞低，经胡桃醌处理后细胞膜流动性增加，有助于诱导细胞分化、从而降低其癌变的恶性度［14］。再者，由于膜流动性的改变，会影响细胞膜上蛋白质的位置，导致细胞膜上的抗原决定簇的暴露或掩盖，从而引起细胞免疫原性的改变。高转移的肿瘤细胞往往呈低免疫原性，使肿瘤细胞对机体免疫功能的逃逸更加有利于癌的转移。而MHC?1类抗原（HLA?ABC抗原）在宿主抵御肿瘤的发生和扩散中起着重要的作用［15］。因此，提高BEL?7402细胞膜流动性，可能会改变膜表面抗原的表达，影响肿瘤细胞的抗原性，进而影响肿瘤细胞的生长及转移。另外，细胞膜流动性增高，可加速细胞膜内一些蛋白分子的扩散和旋转运动，促进药物进入细胞内部，进而诱发肿瘤细胞凋亡［16］。

    综上所述，胡桃醌可以有效的抑制人肝癌BEL?7402细胞的增殖，其发挥作用的机制可能是通过加快细胞膜流动性，促进胡桃醌本身进入细胞内，诱发细胞的凋亡。

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