姜黄素对人子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

                 作者：李伟宏 焦金菊 王青青 常志杰 

【摘要】  目的：探讨姜黄素对人子宫内膜癌细胞(HEC?1B)增殖和凋亡的影响。方法 ：应用6.67～66.67μmol/ L的姜黄素分别处理HEC?1B 48h后,采用MTT法检测姜黄素对HEC?1B的增殖程度的影响；流式细胞仪进行细胞周期时相分析；荧光显微镜观察细胞核形态的变化。结果： ①MTT法显示培养48h后，姜黄素组的吸光度值A490nm低于对照组(P<0.01),且在一定浓度范围内呈剂量依赖性；②流式细胞仪检测显示培养48h后，姜黄素组的G2/M比例高于对照组(P<0.05)，且在一定浓度范围内呈剂量依赖性；③荧光显微镜下给药组部分细胞发生凋亡形态学改变，凋亡率为10.22%～34.72%。结论： 姜黄素可抑制HEC?1B的增殖，诱导细胞凋亡，其诱导凋亡的机制可能是通过将细胞阻滞在G2/M期来实现的。

【关键词】  姜黄素； HEC?1B； 增值 ； 细胞周期； 凋亡

姜黄（curcuma）是一种传统的中药，广泛用于食品上色和调味。姜黄素(curcumin)是从姜黄中提取的酚性色素，是姜黄的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂及抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等作用，尤其作为一种具有良好前景的抗癌药物，日益引起人们的关注，成为研究的热点［1］。本实验采用体外细胞培养的方法来探讨姜黄素对人子宫内膜癌细胞（HEC?1B）的作用。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞株  人子宫内膜癌细胞株（HEC?1B）由北京细胞中心提供。

    1.1.2  药物及试剂  MEM培养液，1：250胰蛋白酶，Hoechst 33258染色剂，姜黄素C1386 (美国sigma公司)；标准胎牛血清(standard FBS，天津灏洋生物制品科技责任有限公司，批号20071230)；Annexin V?FITC 试剂盒(晶美生物工程有限公司)。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞增殖的测定（MTT法）  取对数期生长的HEC?1B，胰酶消化制成密度为5×106/ L的细胞悬液，接种于96孔板，每孔200μl。24h后细胞完全贴壁展开，更换培养液，分别设对照孔(不加姜黄素而加等量的培养液)、空白对照孔(不加细胞，其他条件与前相同)和不同浓度(6.67，16.67，33.33，66.67μmol/ L)姜黄素组，每组设12个复孔。将培养板移入CO2孵箱中，培养44h后，每孔加入5g/L MTT溶液10μl，37℃避光孵育4h，终止培养。吸去孔内培养液，每孔加入100μlDMSO溶解振荡15min，待结晶物充分溶解后(溶解呈蓝紫色)，酶标仪检测各孔吸光值（A490nm）。癌细胞生长抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）。

    1.2.2  细胞周期检测  取对数期生长的HEC?1B，胰酶消化制成密度为5×106 /L的细胞悬液，接种于15个培养瓶内，每瓶4mL，37℃ 培养箱中培养24h，细胞完全展开贴壁。此时换液，分别设对照组和不同浓度的(6.67，16.67，33.33，66.67μmol/ L)姜黄素组，每组3个样本。继续培养48h，终止培养。4℃预冷的PBS冲洗2次，用2.5g/l胰蛋白酶消化成悬液，离心8min，去上清，分别收集于15个EP管，每个EP管加碘化丙啶(PI)1mL，避光孵育15min，用流式细胞仪(FACS)分析细胞周期时相。

    1.2.3  荧光染色凋亡细胞核形态观察  取对数期生长的HEC?1B，胰酶消化制成密度为5×106/ L的细胞悬液，接种于24孔培养板，每孔1.5ml。24h后细胞完全贴壁展开，更换培养液，分别设对照孔和不同浓度的(6.67，16.67，33.33，66.67μmol/ L)姜黄素组，每组4个复孔。继续培养48h，终止培养。移去培养基，用冷的PBS洗3次，4%的多聚甲醛固定30min，弃固定液，PBS冲洗3次，加5mg/L Hoechst33258闭光染色15min,弃掉，PBS冲洗后荧光显微镜下观察细胞核形态，以核碎裂、核固缩、染色体断裂、凋亡小体形成和荧光强度增强等作为凋亡细胞指征。每张片随机选取4个高倍视野，凋亡细胞占每个视野总细胞数的百分比，求出4个视野平均百分比，作为该样本的凋亡百分比，每组取3张盖玻片。

    1.2.4  统计学分析  实验数据以( ±s)表示，应用SPSS11.5统计软件对资料进行单因素方差分析。P<0.05表示差异有显著性意义，P<0.01表示差异有非常显著性意义。

    2  结果

    2.1  姜黄素对子宫内膜癌细胞增殖的影响

    与未加药的对照组相比，给药各组癌细胞的A490nm值明显降低，差异有非常显著性意义 (P<0.01)，且在一定浓度范围内呈剂量依赖性，表明姜黄素对HEC?1B增殖有抑制作用，见表1。 表1  姜黄素对子宫内膜癌细胞增殖的影响注：* P<0.01, 与对照组比较. ΔP< 0.01, 与姜黄素Ⅰ,  #P< 0.01,与姜黄素Ⅱ 。

    2.2  姜黄素对子宫内膜癌细胞周期时相的影响

    与对照组比较，姜黄素作用48h后，子宫内膜癌细胞G0/G1比例降低，G2/M期比例增高。在一定浓度范围内，G2/M期的比例随姜黄素浓度的增加而增加，并呈剂量依赖性，差异有显著性意义 (P< 0.05)，见表2。表2  姜黄素对子宫内膜癌细胞周期的影响注： * P < 0.05, 与对照组比较. ΔP< 0.05, 与姜黄素Ⅰ,  #P< 0.05,与姜黄素Ⅱ 。

    2.3  姜黄素对HEC?1B细胞凋亡的影响

    姜黄素各组作用48h后，荧光显微镜观察发现，与对照组比较，姜黄素各组细胞出现细胞核固缩、细胞核碎裂、凋亡小体等明显凋亡特征性改变（图1）。凋亡百分比从正常的6.81%±1.79%增加到34.72%±1.88% (P<0.01)（图2）。

    3  讨论

    姜黄素是姜科植物姜黄的主要成分，具有多方面的药理作用，尤其是作为一种具有良好前景的抗癌药物，具有抗癌谱广、毒副作用小的优点，最近被肿瘤学家们认为是一种潜在的第三代抗肿瘤药［2］。大量体内外研究证实，姜黄素能抑制结肠癌［3］、肝癌［4］等的增殖，显著减少肿瘤细胞的数目，缩小瘤体大小。本实验应用MTT比色法检测姜黄素对子宫内膜癌细胞增殖的抑制率，结果表明，姜黄素可明显抑制子宫内膜癌细胞增殖，且细胞增殖的抑制率在一定浓度范围内随姜黄素浓度的增加而增加，呈剂量依赖性。MTT试剂可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶还原成蓝色甲瓒颗粒,且甲瓒生成的量与活细胞数量及细胞活化状态成线性关系。因此被广泛用于肿瘤药物的筛选。

    细胞增殖是通过细胞周期来实现的。在细胞生长周期中，存在着两个调节细胞周期正常进行的关键点，即G1/S，G2/M期。近年来大量研究表明，G2/M阻滞与细胞凋亡的发生关系密切，G2/M期阻滞可能是DNA修复期使受损的DNA在染色体分离前得到修复［6］，修复成功的肿瘤细胞继续进入增殖周期。不能修复者则进入凋亡途径。Weir等［7］用姜黄素来处理对顺伯耐药的人卵巢癌细胞，结果表明，姜黄素可干扰细胞周期进程，诱导人卵巢癌细胞凋亡，并使其阻滞于G2/M期。Holy等［8］报道姜黄素可通过干扰正常的纺锤体的形成是肿瘤细胞不能正常的有死分裂，从而发生G2/M期阻滞。本实验用流式细胞仪定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相细胞，用分析软件百分比，结果提示，在一定浓度范围内姜黄素将HEC?1B细胞阻滞于G2/M期，使细胞停止于DNA合成期可分裂末期，且随着姜黄素浓度的增加G2/M期的细胞所占的百分比也随之增加。本实验又应用Hochest33258荧光染色观察了姜黄素诱导细胞凋亡的情况，实验结果表明，随着姜黄素剂量的增加，凋亡率也随之增加，使细胞向凋亡方向发展。由此推断阻止细胞周期进程可能是姜黄素完成其抗肿瘤作用的机制之一。

    综上所述，姜黄素能抑制人子宫内膜癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡。其诱导细胞凋亡的机制可能是通过将细胞阻滞在G2/M期来实现的。与细胞毒类药物相比，姜黄素毒副作用小，有望成为子宫内膜癌的辅助性药物，促进我国传统抗肿瘤药的开发利用，但姜黄素具体通过何种机制阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡以及同目前用于子宫内膜癌常规化疗药物的疗效比较、体内实验是否有着类似的结果、与其它抗肿瘤药物联合应用是否有协同作用等问题，有待于进一步研究。

【】
  1 Lin JK, Pan MH, Lin Shiau SY. Recent studies on the biofunctions and biotransformations of curcumin . Biofactors. 2000, 13(1-4): 153～158．

2 Lin JK, Jin?shiau SY．Mechanisms of cancer chemoprevention by curcumin．Proc Natl Sci Counc ROC(B), 2001, 25(2):59～66．

3 Johnson JJ, Mukhtar H. Curcumin for chemoprevention of colon cancer. Cancer Lett. 2007, 255(2):170～181.

4 Shi shodi a S, Ami n H. M, Lai R, et al . Activation of NFκB is inhibited by cur cumin and related enones.Biochemical Pharmacology, 2005, 70: 700.

5 Bedi A, Barber JP, Bedi GC, et a1. BCR?ABL?mediated inhibition of apoptosis with delay of G2/M transition after DNA darhage: A mechanism of resistance to multiple anticancer agents. Blood, 1995, 86(3): 1148～1158．

6 Weir NM, Selvendiran K, Kutala VK, et al. Curcumin induces G2/M arrest and apoptosis in cisplatin-resistant human ovarian cancer cells by modulating Akt and p38 MAPK. Cancer Biol Ther. 2007, 6(2):178～184.

7 Holy JM, Deming K. Curcumin disrupts mitotic spindle structive and inducesmicronucleation in MCF?7 breast cancer cells. Mutat Res, 2002, 518(1):71～84.