榄香稀对肺癌细胞凋亡的影响

                         作者：许浪 刘丹 晏丹 李玉红

【摘要】  目的： 研究榄香稀对肺癌细胞的凋亡作用。方法： 采用MTT法和Annexin V/PI法检测榄香稀和顺铂作用于肺癌A549细胞株的毒性和凋亡情况，比较榄香稀和顺铂诱导凋亡的差异。结果： 榄香稀细胞半数毒性浓度为102.21 μg/m1，榄香稀具有细胞毒性，且呈量效关系，但弱于顺铂；榄香稀和顺铂均能促进肺癌A549细胞凋亡，两者间无明显差异。结论： 榄香稀可有效诱导肺癌细胞凋亡，对临床用药具有指导意义。

【关键词】  榄香稀； 肺癌； 细胞凋亡

 细胞凋亡对肿瘤的产生、生长速度和预后方面起着非常重要的作用。通过细胞凋亡可直接调节肿瘤细胞的生长。肺癌是发病率较高的肿瘤之一，严重威胁人类的生命。细胞凋亡在维护机体内环境稳定中起重要作用，诱导肺癌细胞凋亡现已成为肺癌的一个研究方向。诱导肺癌细胞凋亡，可能遏制肺癌的发生和。研究证明，顺铂可诱导人白细胞HL?60细胞凋亡，呈现明显的剂量时间依赖性关系；而且低剂量的顺铂对放射有增敏的作用，放射诱导细胞凋亡也是放疗的作用机制之一［1］。顺铂、阿霉素等及放射诱导各种肿瘤细胞凋亡的研究已成为肿瘤治疗的研究热点，但榄香稀诱导肺癌细胞凋亡的研究较少。我们应用细胞培养技术，采用MTT法和Annexin V/PI法检测榄香稀和顺铂作用于肺癌A549细胞株的毒性和凋亡情况，比较榄香稀和顺铂诱导凋亡的差异，为临床肺癌治疗提供实验依据。

    1  材料和仪器

    肺癌A549细胞由武汉大学医学院生命院惠赠，细胞生长液为高糖DMEM(Gibco)，加10％的胎牛血清，100 U/ml青霉素，100U/ml链霉素；新生牛血清，杭州四季清生物工程所生产；榄香稀(elemene emulsion，ELE，5mg/ml)，大连金港制药有限公司；Annexin V/PI试剂盒(Bender Medsystem，USA)。

    5mg/ml的噻唑蓝(MTT)溶液配制：称取噻唑蓝粉剂25mg溶解于5 ml PBS中，搅拌，使之溶解，双层0．22 m滤膜过滤除菌，现配现用。

    仪器细胞培养箱5410型，Napco公司产品；EPICS ALTRAⅡ流式细胞仪(Beckman，USA)；酶标仪(美国BIO?RAD model 550)。

    2  实验方法

    2.1  肺癌A549细胞培养

    肺癌A549细胞采用含10％小牛血清的DMEM培养基，置于37℃，5％CO2条件下培养，常规法培养传代肺癌A549细胞于25mL培养瓶里。用PBS洗细胞3次，然后加入含2％小牛血清的DMEM培养基维持培养，每隔1天更换1次培养基，至细胞进入对数生长期,收集所有细胞。

    2.2  细胞毒性实验（MTT法）

    用细胞维持液分别将榄香稀25μg/m1，50μg/m1，100μg/m1，150μg/m1，200μg/m1，300μg/m1，和顺铂(3μg/m1)分别加入96孔板中已长成单层的细胞中，每个稀释度接种4个复孔，每孔加入100 μ1，置于37℃二氧化碳培养箱中培养48 h后，弃培养液上清，每孔加入含5 mg/ml的MTT溶液50μ1，继续培养2～3h后，弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液DMSO 150μ1，振荡5～10 min，待结晶完全溶解，酶标仪测570 nm处的OD值，波长为630 nm，细胞存活率=药物对照孔OD值/正常对照孔平均OD值(OD值为每孔在570nm处与630nm处吸光度的差值)。根据实验结果计算细胞的抑制率与存活率，通过SPSS13.0软件使用probit回归法计算细胞半数毒性浓度(TC50) 。

    2.3  流式Annexin V/PI法

    分别加入榄香稀(150μg/m1)和顺铂(3μg/m1)的细胞维持液以1:4稀释binding buffer(50mL buffer+150mL蒸馏水)，在稀释的buffer重悬细胞，并调整细胞浓度2×105/mL， 取195μL细胞悬液加入5μL Annexin V?FITC，室温孵育10 min，洗细胞n次后，再重悬细胞于190 μL binding bufer,加入10μL PI，室温孵育10 min，上流式细胞仪检测。

    2.4  流式细胞仪分析

    Annexin V/PI法以氩离子激光器488nm为激发波，分别以525nm、620nm 红色荧光和绿色荧光检测细胞，经流式细胞仪测量软件检测每个样品10 000个细胞，直接测得每个样本10 000个细胞中正常细胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡细胞所占的比例。

    3  结果

    3.1  细胞毒性实验

    目测法结果通过用SPSS13.0软件probit回归分析法，细胞半数毒性浓度(TC50) ,榄香烯为102.21 μg/m1。榄香稀有细胞毒性，有量效关系，但弱于顺铂。结果见表1。

    3.2  流式Annexin V/PI法检测结果

    流式细胞仪Annexin V/PI法检测榄香稀(150μg/m1)和顺铂(3μg/m1)作用下肺癌A549细胞凋亡百分率，见图1。UL区为细胞坏死，LL区为细胞存活，LR区早期凋亡，UR区为晚期凋亡，凋亡总计=LR区+UR区。结果显示顺铂和榄香稀处理后，细胞凋亡增多（表2），凋亡率明显高于对照组（P<0.05）。顺铂组和榄香稀组比较无明显差异（P>0.05）。表1  榄香稀和顺铂对肺癌A549细胞毒性的影响 表2  药物诱导细胞凋亡的结果

    4  讨论

    本实验利用细胞毒性和细胞凋亡的理论，观察榄香稀和顺铂对肺癌细胞的凋亡。药物毒性检测采用MTT分析法，使用MTT［(4，52二甲基噻唑)2，52二苯基四唑溴化物］对细胞进行染色，通过检测其OD值的改变可判断细胞的活性，了解药物对细胞的毒性作用，从而进行药物毒性的定量分析［2］。本实验利用流式细胞仪检测榄香稀诱导肺癌A549细胞的凋亡，其凋亡率增加。

    肿瘤组织细胞的生长速度主要是依靠肿瘤组织细胞的增生与死亡比率。肿瘤组织细胞有两种死亡途径，一是通过肿瘤组织细胞坏死的途径，这是由于各种外界因素作用于肿瘤组织细胞使其死亡，比如因肿瘤组织细胞供血不足而导致死亡；另一途径是细胞凋亡，由肿瘤组织细胞内部在特定的时空发生的，受机体严密调控的细胞"自杀"现象，也就是由肿瘤组织细胞内部调节机制控制的死亡［3］。榄香稀是莪术中的主要成分，经复合乳化剂而制备的抗肿瘤药物，通过诱导肺癌细胞凋亡有可能促使肺癌缩小或消失，存在潜在防止机体和清除体内受损伤而不予以修复的细胞、癌前病变、基因发生改变的细胞。通过诱导肺癌细胞凋亡机制而达到肺癌的目的［4］。本研究表明，榄香稀治疗肺癌作用如下可能通过抑制肺癌细胞生长， 降低肺癌A549细胞分裂能力，抑制其增殖，同时榄香稀治疗肺癌作用达到某一有效剂量，即可发挥强烈的治疗作用，对指导临床用药具有重要意义。

【】
  1 Courtemanche C，Huang AC，Elson?Schwab I，et a1．Folate deficiency and ionizing radiation cause DNA breaks in primary human lymphocytes：a comparison．FASEB J，2003，3［Epub ahead ofprint］．

2 袁冬生，王新华，李常青，等.复方肝癌宁含药血清诱导肝癌细胞凋亡的实验研究.世界华人消化杂志，2006，14（5）：522～525.

3 益气养阴散结方含药血清对A549细胞凋亡及生成素基因表达影响的实验研究.时珍国医国药,2008,19(1):73～75.

4 沈世林，赵健雄，朱玉真，等.复方中药制剂对肿瘤细胞NF?B表达及其凋亡影响的实验研究.四川中医，2004，23（7）：12～13.