兔实验性蛛网膜下腔出血后脑血管超微结构的病理特征与动态变化
作者：宋锦宁，梁琦，张明，陈五岭
【摘要】 目的 探讨蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管的超微结构特征与动态变化，以及这种改变在迟发性脑血管痉挛(CVS)中的作用机制。方法 对日本大耳白家兔采用枕大池二次注血法制做SAH模型。动物随机分为SAH组、盐水对照组、穿刺对照组和正常组，于注血后1h、第3天、第5天、第7天、第10天灌注固定，留取基底动脉标本，在光镜和电镜下动态观察基底动脉的病理和超微结构的改变。结果 光镜下SAH模型组的主要表现是血管壁增厚，管腔狭窄，内皮细胞变性、肿胀，染色质不均，空泡形成；内弹力膜迂曲皱褶或断裂。电镜下超微结构的主要表现是基底动脉内皮细胞间紧密连接消失，胞膜部分或完全脱落，胞质内线粒体肿胀、嵴紊乱、溶解呈空泡，致密颗粒增多，细胞核内染色质边集、浓缩，异染色质增多；平滑肌细胞变形、核扭曲、染色质不均匀，肌丝排列疏松紊乱，出现断裂或溶解，胞浆内可见大量空泡形成，线粒体增多、肿胀、嵴紊乱或溶解；血管外膜神经纤维肿胀、结构模糊。光镜下基底动脉的结构变化趋势与电镜下基底动脉的结构变化趋势相类似，均在SAH后1h时可发现结构的微小改变，从第3天开始明显的结构改变，在第5天至第7天结构变化最明显。结论 SAH后脑血管的超微结构会发生损害，并在病程中呈明显的动态改变；血管内皮细胞的损害是导致迟发性CVS的重要因素之一。
【关键词】 蛛网膜下腔出血；病理改变；超微结构；迟发性脑血管痉挛
The ultrastructural pathological characteristics and dynamic changes of brain vessel after subarachnoid hemorrhage in experimental rabbits
ABSTRACT: Objective To discuss the ultrastructural pathological characteristics and dynamic changes of brain vessel after subarachnoid hemorrhage (SAH), and the mechanism of these changes in delayed cerebral vasospasm. Methods SAH model was made by infusing blood twice into the cistern magna of Japanese rabbits. The animals were divided randomly into SAH group, saline group, puncture group and blank group, at 1h, 3d, 5d, 7d and 10d after the first infusion the animals were perfused and basilar artery was harvested. Ultrastructural changes were observed under light microscope and electron microscope. Results Under the light microscope, the vessel wall became thick, the vessel cavity became narrow, the endothelia cells became swollen, vacuoles could be found in the chromatin, inner elastic membrane became reductus and broke. Under the electron microscope, the close connection between the endothelial cells disappeared, the membrane of the cells fell off, and the mitochondria became swollen, vacuoles could be seen, the chromatin became concentrated, heterochromatin could be seen, smooth muscle became deformed, chromatin became uneven, myofilament had derangement and fragmentation and dissolved, vacuolus could be seen in the kytoplasm, mitochondrion became swollen. The structural change of basilar artery under the light microscope got similar to that under the electron microscope; slight change was observed right after 1h of SAH, significant change was observed at 3d, and most obvious change was observed between 5d and 7d. Conclusion Ultrastructural changes were observed in the basilar artery after SAH, and significant dynamic changes were observed in the progress. The damage of endothelia cells may be the important factors which cause delayed cerebral vasospasm.
KEY WORDS: subarachnoid hemorrhage; pathological change; ultrastructure; delayed cerebral vasospasm
蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)后最重要的病理变化之一就是迟发性脑血管痉挛(cerebral vasospasm, CVS)。它是导致延迟性缺血性神经功能障碍最主要的致病因素之一。但是，由于缺乏明确的病因学资料，在临床上诊断和迟发性CVS均比较棘手。虽然国内外许多学者针对其发病机制进行了大量的临床和基础研究[1?4]，但对迟发性CVS的病理过程及病理机制仍然缺乏深入的认识。本实验采用枕大池二次注血法建立兔SAH后CVS模型，动态观察了迟发性CVS后基底动脉超微结构的变化。旨在进一步探讨SAH后迟发性CVS的发生机制。
1 材料与方法
1.1 材料 实验动物为日本大耳白家兔，45只，雌雄不拘，健康状况良好，体重(2.5±0.4)kg，在相同的条件及环境中(饲料和温度均相同)饲养一周后进行实验。所有实验用兔均购自西安大学医学院实验动物中心。
实验试剂及药品：40g/L多聚甲醛灌注液购自西安交通大学医学院器材科；250g/L乌拉坦溶液、0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液，即PBS缓冲液以及修复液均由西安交通大学医学院组织胚胎与解剖实验室提供；自制PBS配制的2.5g/L戊二醛固定液；利多卡因注射液及手术器械由西安交通大学医学院第一附属神经外科提供。
1.2 实验分组 动物随机分组：SAH模型组20只，盐水对照组15只，穿刺对照组5只，空白对照组5只。SAH模型组根据建立模型后的不同时间段分为5个亚组，分别是：建模后的1h、3d、5d、7d、10d组。每个亚组4只动物。盐水对照组亦根据建模后不同时间段分为5个亚组，分别是：建模后的1h、3d、5d、7d、10d。每个亚组3只动物。穿刺对照组和空白对照组分别取5只做脑血管超微结构研究。
1.3 动物模型的建立 白兔于枕部剃毛，消毒后于枕部中线作一直切口，长约2.5cm，锐性分离直达寰枕筋膜，充分显露寰枕部，用18G套管针与躯体成角约30°穿刺枕大池，方向指向右眼外眦，当穿破环枕筋膜时有突破感，停止进针，退出针芯，此时可见清亮脑脊液流出。取兔耳中央动脉的非抗凝血1.5mL/kg，以0.5mL/s的速度缓慢注入枕大池内。退出套管针，局部压迫后，缝合切口，取侧卧头低30度位放置30min，使血液聚集在脑基底池。首次注血后48h，由兔耳中央动脉取血1mL/kg，按上述方法，再次注入枕大池内。
1.4 标本采取 所有大耳白家兔饲养到对应时间后，用250g/L乌拉坦以3mL/kg麻醉，打开胸腔，剥开心包膜，暴露心脏，将下腔静脉和腹主动脉然后用动脉夹夹闭，剪开右心耳放出血液，再剪开左心室将灌注头插入主动脉然后用动脉夹固定，先输入9g/L生理盐水将血管内的血冲洗干净，再注入40g/L的多聚甲醛固定液2000mL灌流固定。在处理电镜组织标本的时候，用相同方法将生理盐水灌注干净后，再用2.5g/L的戊二醛固定液1000mL灌注固定后，将基底动脉固定于电镜固定液中，待制作电镜标本。
透射电镜标本：将基底动脉标本用电镜固定液固定，采用常规电镜标本制作方法，经清洗、脱水、浸透、包埋和修块后作超薄切片，在透射电镜下观察。
扫描电镜标本：将基底动脉血管于固定前在显微镜下纵向剖开，同法将基底动脉标本用电镜固定液固定，按常规扫描电镜样品制作方法制备后在扫描电镜下观察。
2 结果
2.1 SAH的大体观察 实验动物在造模后的不同时间经多聚甲醛灌注取脑， 其中SAH模型组在1h可见广泛的SAH，全脑未见明显的凝血块，3d、5d、7d可见枕大池、基底池附近及基底动脉周围明显的凝血块，随时间的推移，凝血块的范围、大小和颜色呈现减退，至第10天，枕大池、基底池及基底动脉周围凝血块已经基本消失，但仍可见少量SAH。
2.2 基底动脉血管内皮的HE染色的光镜结构变化 穿刺对照组、盐水对照组的血管结构与正常组一样，血管壁无增厚，内皮细胞结构完整，内弹力膜清晰可见，结构完整；中膜主要是平滑肌细胞及其周围的细胞外基质；外膜主要由成纤维细胞和疏松的结缔组织构成。SAH模型组可见血管壁增厚，管腔狭窄，内皮细胞变性、肿胀，染色质不均，空泡形成；内弹力膜迂曲皱褶或断裂，厚薄不均；中膜增厚，平滑肌细胞排列紊乱；外膜可见淋巴细胞或单核细胞浸润。
2.3 透射电镜下的基底动脉超微结构的变化 电镜下正常血管壁超微结构可见内皮细胞间紧密连接，呈纺锤形，其内含有少量的吞饮小泡，线粒体结构正常。弹力层排列整齐，肌丝排列规则(图1A)。SAH实验组中，1h开始就可观察到有内皮细胞间连接变宽，有空泡形成，平滑肌细胞肿胀(图1B)；3d开始可见明显内皮结构改变(图1C-图1E)，至7d最严重(图1F)，随后开始慢慢恢复(图1G)。超微结构变化主要可见内皮细胞间紧密连接消失，胞膜不完整，部分或完全脱落，胞质内线粒体肿胀、嵴紊乱、溶解，致密颗粒增多；胞质可见较多的致密颗粒，高尔基体部分囊化，胞质呈溶解状；细胞核内染色质边集、浓缩，异染色质增多；内弹力膜明显皱褶、裸露、厚薄不均；胶原纤维向内皮层生长，弹力层明显扭曲呈波纹状，平滑肌细胞变性、核扭曲、染色质不均匀，肌微丝排列疏松紊乱，出现断裂或溶解，可见片状高电子密度物质，胞浆密度不均，内可见大片溶解区、溶酶体样致密小体及线粒体增多，增多的线粒体大多肿胀、嵴紊乱或溶解；血管外膜神经纤维肿胀、结构模糊，偶见炎性细胞浸润。而盐水对照组和穿刺对照组的超微结构没有明显的改变，基本与正常组相同。
2.4 扫描电镜下的基底动脉血管的超微结构的变化 正常组血管内皮光滑，无异常改变。SAH实验组血管内皮肿胀、边界不清、排列紊乱，可见内皮细胞碎裂和间断缺损，有纤维蛋白凝块沉积，血栓附着(图1H)。
图1 透射电镜下的正常基底动脉结构与SAH模型组的基底动脉超微结构的变化(A-G)，以及扫描电镜下的SAH模型组血管内皮细胞的变化(H)（略）
Fig.1 The normal basilar artery structure and the changes of basilar artery ultramicrostructure in SAH group under transmission electron microscope (A-G), and the changes of vascular endothelial cells under scanning electron microscope (H)
A: normal vascular structure (endothelium, smooth muscle and tunica adventitia, ×2000); B: the abnormal endothelial cell?cell junction in 1h after injecting blood, and there was vacuolization (×30000); C: smooth muscle cellular swelling in 1h after injecting blood (×10000); D: the elasticity membrane was broken in 3d after injecting blood, and smooth muscle cells grew toward breakage place (×10000); E: the endothelial cells were amotic in 5d after injecting blood (×3500); F: the endothelial cells nuclear swelling, the appearance and thickness were asymmetrical in elasticity tunica interna (×3500); G: the endothelial cells, elasticity membrane and smooth muscle in 10d after injecting blood (×3500); H: under scanning microscope it could be seen that the basilar artery vascular endothelium became swollen, had obscure boundary and arrangement in chaos on 7th day of SAH group; and endotheliocytes broke in pieces and had discontinuous defect, and there could be seen fibrin clot deposition, and thrombus cohering (×2000)
3 讨论
SAH后脑血管是否有病理性变化及其变化特点，众多学者说法不一，Tanabe等[5]认为SAH后痉挛的脑血管可出现超微结构的改变，Smith等[6]认为脑血管的病理性改变是造成迟发性CVS的原因，而Clower[7]在其实验中却未发现有血管壁的超微结构的改变。虽然，关于迟发性CVS的发病机制及其病理基础也存在较大争议,但是，在大量SAH患者尸检和实验性SAH 动物模型研究中均发现痉挛的血管内皮细胞存在明显的病理改变[8]，大量研究均认为血管内皮细胞损害在CVS的发生、中具有重要作用。但是，目前对SAH后血管内皮细胞的损伤机制尚不十分明确[9]。在体内研究中，内皮细胞的损害一方面可能由蛛网膜下腔积血及分解产物所引起的毒性所致。另一方面,痉挛的血管持续强烈地收缩也可继发内皮细胞的机械性损伤，两者作用难以区分。
本实验通过枕大池二次注血法建立兔SAH后CVS的模型，动态观察了兔SAH后基底动脉血管的大体形态、光镜结构和超微结构的变化。在大体形态中观察到广泛的SAH和枕大池、基底池附近的凝血块，印证了CVS发生的首要条件是血管长时间浸泡在SAH的积血中[10]，导致其收缩?舒张平衡[11]的自我调节机制紊乱，管壁顺应性和舒张功能下降与收缩功能增强。在光镜和电镜结构变化中观察到，随着注血后时间的推移，光镜下基底动脉的结构变化趋势与电镜下基底动脉的结构变化趋势相类似，均在1h时可发现结构的微小改变，从第3天开始出现明显的结构改变，在第5天至第7天达到结构变化最明显和病变最严重的时间。这与赵振伟等[12]研究结果相同。
Omoo等[13]研究认为SAH后痉挛血管的病理改变首先是内皮细胞的损伤，而正常内皮功能的实现是依靠内皮细胞的完整性。Findlay等[14]在猴SAH 模型中观察到血管内皮细胞出现明显的超微病理损害，如细胞变性、破坏溶解、细胞间隙增宽和细胞间紧密连接断裂等，并可导致内皮细胞脱落。我们在实验中也观察到，在光镜下内皮细胞变形、肿胀，染色质不均，在电镜下内皮细胞间紧密连接消失，胞膜不完整，部分或完全脱落，胞质内线粒体肿胀、嵴紊乱、破坏溶解，致密颗粒增多；血管内皮细胞间紧密连接的破坏消失可减弱血管内皮细胞的屏障作用。内皮细胞的这些变化直接影响到血管的正常功能，引起细胞转导途径等的一系列的改变。内皮细胞机能障碍可使内皮素?1在血管内皮的含量增加，而降钙素基因相关肽的含量减少，引起血管的收缩?舒张物质平衡被打破，可能是引起血管痉挛的直接原因。同时在实验中还观察到，光镜下内弹力膜迂曲皱褶或断裂，厚薄不均，电镜下内弹力膜明显皱褶、裸露、厚薄不均，胶原纤维向内皮层生长，弹力层明显扭曲呈波纹状，平滑肌细胞变形、核扭曲、染色质不均匀，肌丝排列疏松紊乱。弹力膜与平滑肌细胞的这些改变可以引起血管壁的不规则增厚，间接的导致了管腔的缩窄。弹力膜的结构变化表现在大体结构中就是血管的缩窄性改变，但并不意味着发生血管缩窄性改变就一定会有CVS和迟发性神经功能障碍的发生。它的意义是仅仅提供了CVS发生的结构基础。
Park等[15]研究发现发生CVS的血管壁中可见免疫球蛋白IgG及补体C3的沉积，由此推论在CVS的发生中炎症反应可能是机制之一。亦有研究证明：血浆与脑脊液中内皮素?1水平升高可以引起CVS[16]。线粒体是细胞进行生物氧化、供能和储能的主要结构，其数目多少与细胞种类及功能状态有关。在正常情况下血管内皮细胞和平滑肌细胞内的线粒体较少，而当细胞受内外因素作用影响时，线粒体出现反应最早，变化也最明显。从SAH模型组中可以观察到线粒体大多肿胀、嵴紊乱或空化，以第5天到第7天组最为明显，线粒体功能明显异常。这可能与迟发性CVS所导致的神经功能障碍有关。我们在电镜观察中发现，基底动脉在1h时仅有内皮细胞间连接变宽，胞质破坏溶解，平滑肌细胞可见肿胀。总体来看，由于受到血管收缩?舒张调节机制紊乱以及CVS、炎症反应等的影响，进而线粒体膜通透性改变，导致线粒体肿胀、嵴紊乱或破坏溶解，促使细胞代偿性增加或直接生成线粒体增加。而上述因素的存在又使得增加的线粒体不能发挥正常的功能，导致细胞缺氧、功能障碍。这些因素长时间的存在使得超微结构功能缺失不断加重，同时可能引起降钙素基因相关肽减少，内皮素?1增加，影响正常内皮细胞的功能，打破了血管的收缩?舒张平衡，导致CVS的发生[17]。从实验可以看出CVS在第5天左右达到最高峰，也就是细胞功能缺损最严重的时间段；而其在发病初期表现的并不显著。
本实验结果表明：①SAH后CVS的发生与脑血管的病理改变密切相关；②SAH后脑血管超微结构的主要改变是内皮细胞紧密连接消失、髓鞘溶解、线粒体肿胀、嵴紊乱或破坏溶解；平滑肌层扭曲、断裂；③SAH后血性脑脊液可直接造成明显的血管内皮细胞病理形态学损害,并对血管内皮细胞代谢和增殖具有明显的抑制作用。这种内皮细胞的损害使得脑血管腔发生缩窄性改变，导致CVS的发生。提示减轻SAH后内皮细胞的损害、促进内皮细胞代谢可能是CVS策略中的重要环节。
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