睾丸扭转对大鼠生精能力的影响及维拉帕米的保护作用

【摘要】  目的:探讨钙离子通道拮抗剂(维拉帕米,verapamil)对大鼠睾丸扭转复位后睾丸细胞损伤的保护作用。方法:选用出生1个月左右的健康雄性ＳＤ大鼠30只,随机平均分成3组，手术制作幼鼠睾丸扭转模型（720°,2h）。对部分扭转组应用生理盐水或钙离子通道拮抗剂(维拉帕米)。术后6个月处死,取两侧睾丸标本，测定睾丸NO含量、NOS活性，并制备细胞悬液，检测记录每样本中单倍体细胞占细胞总数百分比。结果:B组（扭转组）单倍体细胞占细胞总数明显下降，而且睾丸组织NO含量、NOS活性升高，维拉帕米可减轻上述变化。结论:维拉帕米可以提高睾丸组织单倍体细胞的百分比，在一定程度上可以减轻睾丸组织损伤，对睾丸的生精能力有明显的保护作用。

【关键词】  睾丸扭转;维拉帕米;流式细胞术;一氧化氮

    【ABSTRACT】  Objective:To investigate the protective effect of verapamil on the testis after testicular torsion in rats. Methods: 30 healthy male Sprague?Danley rats(one?month?old) were randomly divided equally into three groups. A model of testicular torsion (720 degree, 2hours) were created. Normal saline or Ca2+ channal blocker(verapamil) were administrated in the intervention groups. Six months laters, nitric oxide (NO), nitric oxide synthase activity (NOS) were measured in both testis of the rats. And the DNA content were measured by flow cytometry, the percentage of monoploid were recorded.Results: After torsion NO and NOS activity increased greatly in both side, and showed obviously more in the torsive side; The percentage of monoploid significantly decreased in the B group(testicular torsion) ,verapamil could reduce the extent of these changes. Conclusion: The verapamil could raise the percentage of monoploid in testis and reduce the extent of damages.

    【KEY WORDS】  Testicular torsion; Verapamil; Flow cytometry; Nitric oxide

    睾丸扭转是一种泌尿外科的急症,好发于青春期前后的儿童。动物实验及临床研究表明,急性睾丸扭转,即使没有睾丸组织的梗死出现,缺血后的睾丸血供恢复到正常水平,仍可出现睾丸生精功能的损害,生育能力的减低[1]。我们通过建立大鼠睾丸扭转模型,测定NO含量、NOS活性，用流式细胞技术检测睾丸内各种细胞的DNA含量,以此了解其生成精子的数量变化及钙离子通道拮抗剂(维拉帕米)对减轻睾丸细胞损伤的作用。

    1  材料与方法

    1.1  动物模型建立与分组

    选用出生1个月左右SD雄性健康大鼠(体重180～200ｇ)30只，分为实验组（22只）和对照组（8只），2%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉。按下列要求实验：

    A组(对照组)：8只大鼠，左侧阴囊切开,游离暴露睾丸,依扭转模型随意搬动,但不予扭转,阴囊缝合关闭。

    B组（扭转组）：11只大鼠，左侧阴囊切开,绕精索顺时针扭转睾丸720°,肉膜白膜缝合固定防止自发复位,阴囊缝合。2ｈ后,第二次切开左侧阴囊,将扭转的睾丸复位固定,缝合阴囊。

    C组（维拉帕米组）：11只大鼠，方法同B组,复位前30min尾静脉缓慢注入维拉帕米注射液（1mg/kg）。

    1.2  标本处理

    1.2.1  睾丸匀浆的制备

    所有动物模型按组分笼饲养,术后6个月处死,采取两侧睾丸标本。经事先称量,各组动物身长、体重差异无显著性意义。剔净睾丸附着筋膜,冷生理盐水洗净血污后滤纸拭干、称重。用天平称取睾丸组织约0.15g,加入9倍冷生理盐水,用眼科剪剪碎后转入组织匀浆器中,睾丸匀浆4000r/min离心15min，取上清液严格按试剂盒说明书进行NO含量、NOS活性测定（试剂盒购自南京建成生物医学工程研究所）。

    1.2.2  睾丸单细胞悬液的制备

    用眼科剪把双侧睾丸一并剪碎，用B?D公司生产的Medimachine及其配套产品制成单细胞悬液。用PBS分别洗涤三次标本，弃去上清液，用PBS调整细胞浓度到1.0×106细胞/ml。①分别取100μl样本，加入CycleTest TM Plus DNA试剂盒A液250μl，轻轻摇匀不要震荡，室温静置10min，②分别加入200μl B液，轻轻摇匀不要震荡，室温静置10min，③分别加入200μl C液，轻轻摇匀不要震荡，低温（2～8℃）避光静置10min。加入C液2h内用流式细胞仪（FACScalibur)Cellquest软件测定。用ModFITLT for mac v3.0软件分别进行数据分析,记录每样本中单倍体细胞占细胞总数百分比。

    1.3  统计学分析  按组别对流式细胞仪检测结果予以方差分析,各组结果两两比较,所有结果以SPSS统计软件包处理。

    2  结果

    2.1  维拉帕米对睾丸扭转NO含量及NOS活性影响

    B组NO含量、NOS活性，扭转侧和对侧分别与正常对照组比较，NO含量、NOS活性均显著升高（P＜0.05）；扭转侧较对侧变化显著（P＜0.05）。C组与B组扭转侧和对侧分别比较，NO含量、NOS活性均降低（P＜0.05）(表1)。

    2.2  维拉帕米对睾丸扭转单倍体细胞的作用

    表1  各组NO含量、NOS活性比较注：*P＜0.05，**P＜0.01，vs control；△P＜0.05，vs B组对侧;#P＜0.05，vs B组扭转；+P＜0.05，vs B组对侧。

    A组、B组和C组单倍体细胞分别占细胞总数的(72.9±1.9)%、(50.6±2.2)%、和(68.1±1.6)%。各组结果两两比较,统计学上差异均有显著性意义,说明青春期前睾丸扭转影响大鼠性成熟后的生精能力,钙通道拮抗剂(维拉帕米)在一定程度上可以减轻组织损伤。

    3  讨论

    正常睾丸组织有防御氧自由基损伤的机制，如SOD、GSH等能迅速清除O2－、OH－等自由基，而在再灌注组织中SOD、GSH等由于大量消耗从而降低，而NO在缺血再灌注损伤中具有双重作用[2，3]。本实验表明，一侧睾丸扭转复位后（B组）扭转侧和对侧睾丸NO含量、NOS活性升高，扭转侧较对侧变化显著；说明对侧睾丸损伤是由于睾丸复位后再灌注损伤引起。NO过量产生是对侧睾丸损伤的重要原因,与王晓康报道一致[4]。应用维拉帕米后,NO含量、NOS活性降低，说明组织抗氧自由基对脂质膜损害、清除活性氧、防止O2-、OH-对组织损伤的能力明显提高，在一定程度上减轻了睾丸扭转损伤,提高了扭转睾丸的生精能力。

    实验结果显示,大鼠睾丸扭转模型产生单倍体细胞的百分比都较正常对照组有明显下降，说明青春期前睾丸扭转会导致个体成年以后精子数量低下，影响生育。应用维拉帕米后,睾丸组织单倍体细胞占细胞总数比例明显提高，表明维拉帕米可干预睾丸扭转的损伤，保护睾丸的生精能力。近年来研究证实，睾丸扭转是由于组织缺氧,生精细胞对低氧损伤敏感,复位时血供恢复,损伤加重造成[5，6]。而对侧睾丸损伤是由于睾丸复位后再灌损伤引起，当组织缺血时,由于缺氧、底物供应缺乏及利用障碍,致ATP生成减少,影响跨膜离子转运。ATP缺乏导致Na+、Ca2+入胞,K+出胞,同时由于Na+—K+—ATP酶失活,Ca2+在胞浆 内及线粒体内潴留。细胞内钙离子既是损伤因子,又可能充当第二信使，细胞内游离钙超载时,激活钙离子依赖性核酸内切酶,使双链DNA在核小体Linker部位裂解,形成DNA裂片[7]。另一方面,钙超载时可活化蛋白酶Ｃ,令其转移至细胞膜,使G—蛋白磷酸化,G蛋白减少,胞内cAMP增加,导致细胞凋亡[8]。钙通道拮抗剂能阻止钙离子进入细胞内，引起某些器官中血管平滑肌松弛，提高睾丸组织抗氧自由基的能力，减轻高浓度的NO对细胞的损害作用，保护睾丸的生精能力。

【】
  1 孙杰，刘国华，沈立松,等.青春期前睾丸扭转对大鼠生精能力的长期影响/[J/].中华小儿外科杂志，2001,22（1）：52?53

2 Ozokutan BH, Kucukaydin M, Muhtaroglu S, et al. The role of nitric oxide in testicular ischemia?reperfusion in jury/[J/]. J Pediatr Surg,2000,135: 101?103

3 Dokucu AI, Ozturk H, Ozdemir E, et al. The protective effects of nitric oxide on the contralateral testis in prepubertal rats with unilateral testicular torsion/[J/]. BUJ International,2000,85: 767?771

4 王晓康,易建华,张吉才,等.一氧化氮在一侧睾丸扭转对侧睾丸损伤中的作用/[J/].男杂志,2004,18(2):26?28

5 刘子明,郑新民,李世文,等.大鼠睾丸扭转后生殖细胞凋亡与Ｂcl?2和Ｂax基因表达/[J/].中华男科学,2003,17(1):40?42

6 王浩,王常林,王伟,等.兔睾丸扭转复位后睾丸细胞凋亡的观察/[J/].中华小儿外科杂志,2002,23(6):543?545

7 Yeh ET. Life and death in the cardiovascular system/[J/].Circulation, 1997, 95:785?790

8 Fliss H,Gattinger D.Apoptosis in ischemic and reperfused rat mycardium/[J/].Circ Res, 1996, 79:949?954