端粒功能失调与染色体断裂-融合-桥周期在头颈部鳞状细胞癌的研究

                                         作者：吕梅 刘佐庆 董震 杨占泉

【关键词】  端粒功能失调

    【摘要】 目的  通过对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系染色体端粒的表达和细胞分裂形态的检测和分析，研究端粒功能失调和染色体断裂-融合-桥（BFB）现象是否存在于HNSCC，探讨二者之间潜在的关系及在促进肿瘤染色体变异中的重要作用。 方法  对8例HNSCC细胞系和6例头颈部正常组织上皮细胞进行培养。收获细胞经苏木素和伊红染色，分析分裂后期细胞形态，分裂后期染色体桥细胞占分裂后期细胞的百分率。用荧光结合（CCCTAA） 3 核酸探针以荧光原位杂交方法检测细胞分裂中期染色体末端端粒表达，计算平均每个细胞中端粒缺失染色体末端数。HNSCC组端粒缺失染色体末端数/细胞与分裂后期染色体桥百分率直线相关分析。肿瘤组与对照组数据平均值采用t检验。 结果  HNSCC细胞系分裂后期染色体桥现象细胞平均占分裂后期细胞的百分率为（22.7±9.9）%;缺失TTAGGG重复DNA序列的染色体末端数/细胞的平均数为12.8±5.4。两者之间呈显著的正相关，r=0.797，P<0.01。而正常对照组上皮细胞不表现或仅偶尔出现细胞分裂后期染色体桥及端粒缺失现象，二者平均值分别为（1.6±1.4）%和0.3±0.3。肿瘤组和对照组的两组数据平均值比较差异均有显著性，t值分别为4.43、5.68，P<0.005。 结论  HNSCC染色体端粒功能失调造成双着丝粒及环状染色体形成，促使癌细胞进入BFB周期，致使HNSCC染色体不断变异，进而导致大量基因组失衡。

    关键词  头颈部鳞状细胞癌 染色体 端粒 断裂-融合-桥周期

    Telomeric dysfunction and chromosomal breakage-fusion-bridge cycle in head and neck squamous cell carcinomas.

    【Abstract】 Objective To explore the mechanisms of chromosome aberrations，we studied the chromosome telomeres expression and anaphase morphologies in head and neck squamous cell carcinoma（HNSCC）cell lines.Methods Cell cultures of8HNSCC cell lines were stained with haematoxylin and eosin，to analyze mitotic cells with anaphase bridge morphology.Chrosomal telomeric TTAGGG repeats were detected by in situ hybridization with fluores-cein-conjugated（CCCTAA）3peptide nucleic acid probes.Epithelial cell cultures from6normal head and neck tis-sues were used as normal controls.Results All HNSCC cell lines showed TTAGGG-negative chromosome ends with the mean number of12.8±5.4per cell;and presented anaphase bridges at the frequency of22.7±9.9%.More-over，the frequency of anaphase bridges was positively correlated to the mean number of negative telomeric ends，（r=0.797，P<0.01）.On the other hand，the normal controls scarcely present the two events，with the average numbers of0.3±0.3and1.6±1.4%.The mean numbers of HNSCC cell lines were significantly higher than those of normal controls，P<0.005.Conclusion Shortening of telomeric repeats disrupted normal mitotic process by triggering chro- mosomal BFB cycles，thus led to the development of complex chromosome aberrations and genomic imbalances.

    Key words head and neck squamous cell carcinoma chromosome telomere breakage-fusion-bridge cy-cle

    头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）常表现为大量、复杂的染色体变化，但其潜在的机制目前尚不完全清楚。早期细胞遗传学研究提出染色体的断裂-融合-桥（BFB）循环是促进染色体不断变化的重要机制之一。这种现象大体表现为细胞分裂后期的异常形态―核间桥 ［1］ 。另外，端粒是人类染色体末端一组TTAGGG DNA重复顺序，具有维持染色体稳定性的功能 ［2］ 。在鼠上皮癌的研究中发现端粒的缩短或丢失可引起染色体末端的融合，促进染色体BFB循环 ［3］ 。本研究通过对HNSCC细胞系染色体端粒的表达和细胞分裂形态的检测和分析，研究端粒功能失调和染色体BFB现象是否存在于HNSCC，探讨二者之间潜在的关系及在促进肿瘤染色体变异中的重要作用。

    1 对象与方法

    1.1 研究对象 8个HNSCC细胞系，来源部位:喉部3例，鼻窦部2例，口腔2例，鼻咽部1例（香港大学解剖教研室Sai-Wah Tsao教授惠赠）;6例正常对照组织:2例下鼻甲黏膜上皮（来自耳鼻喉科鼻整形患者），2例鼻咽部黏膜上皮（来自鼻咽癌患者正常侧活检），2例正常喉黏膜组织（来自喉癌患者），短期传代（≤4代）上皮细胞培养。

    1.2 细胞培养 头颈鳞状细胞癌细胞系在RPMI1640培养液（含10%小牛血清，100IU/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素和2.5μg/ml两性霉素）、载玻片培养瓶中培养。正常对照上皮组织剪碎后，在含180u/ml胶原酶Ⅱ，37℃孵育过夜;然后放入胶原包被的载玻片培养瓶中培养。其培养液为角化细胞培养液（含0.23mg/ml的L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素和2.5μg/ml两性霉素）。细胞大体生长状态是在倒置显微镜下观察，当细胞生长到90%满时，拆除培养瓶顶壁，收获载玻片。

    1.3 分裂细胞形态学分析 含有细胞的载玻片经PBS清洗5min后，在甲醇∶乙酸（3∶1）溶液中-20℃固定30min，空气干燥，苏木素和伊红染色。光学显微镜分析分裂后期细胞。

    1.4 端粒荧光原位杂交检测 染色体载玻片用含10mg/ml胃蛋白酶的0.01M HCl37℃作用15min。1%甲醛固定10min。70%、85%、100%酒精系列脱水。滴加荧光结合（CCCTAA） 3 核酸探针（瑞典Lunder大学Gisselsson博士赠给）5μl，加盖玻片，80℃变性2min。室温下湿盒内杂交2h。于70%甲酰胺15min2次。经系列脱水后DAPI20μl复染。细胞遗传学影像分析仪荧光显微镜下观察及摄像。

    1.5 统计学方法 计算平均每个细胞中端粒缺失染色体数，每个细胞系至少分析20个细胞。计算分裂后期核间桥细胞占分裂后期细胞的百分率，每个细胞系至少观察150个分裂后期细胞。肿瘤组与对照组数据平均值采用t检验，P<0.05为差异有显著性。端粒缺失染色体数/细胞与分裂后期核间桥百分率直线相关分析。

    2 结果

    HNSCC细胞系细胞分裂后期，均表现有异常的分裂形态―染色体桥现象，平均占分裂后期细胞的百分率为（22.7±9.9）%（图1）;并表现不同程度的染色体末端TTAGGG荧光信号缺失（代表端粒过度缩短或丢失），缺失TTAGGG重复DNA序列的染色体末端数/细胞的平均数为12.8±5.4（图2）。两者之间呈显著的正相关，r=0.797，P<0.01（图3）。而正常对照组上皮细胞不表现或仅偶尔出现细胞分裂后期染色体桥及端粒缺失现象，二者平均值分别为（1.6±1.4）%和0.3±0.3（图4、图5）。肿瘤组和对照组的两组数据比较差异均有显著性，t值分别为4.43、5.68，P<0.005，见表1。

    表1 HNSCC细胞系和正常对照组分裂后期染色体桥现象与染色体末端TTAGGG荧光信号检测结果 （略）

    图3 HNSCC细胞系分裂后期染色体桥百分率

    3 讨论

    BFB周期双着丝粒染色体可来源于:（1）姐妹染色单体断端融合;（2）环状染色体姐妹染色单体互换可使两平行环染色单体变成一条双倍长度含双着丝粒的环;（3）两个同时断裂的染色体片段断裂端融合 ［1］ 。BFB周期引起的染色体多次断裂、融合，造成了断裂点处染色体成分的易位、重组，基因的突变、扩增及丢失。荧光原位杂交试验分析证实，构成分裂后期细胞染色体桥成分的染色体比其他染色体更多地参与了染色体结构的改变 ［4］ 。以断裂染色体姐妹染色单体断端融合为例，该双着丝粒染色体经S期复制，在分裂后期成为核间染色体桥。染色体不对称断裂后，造成含2个拷贝的某些染色体成分和丢失该成分的染色体断端分别分配入两个子细胞中。当子细胞中染色体断端染色单体再次融合、复制，进入下一细胞分裂周期及BFB周期，则必将导致某些基因成分的不断扩增及某些基因成分的不断丢失 ［5］ 。有趣的是染色体的易裂点往往是DNA修复、检测基因和促进细胞分裂增殖的癌基因的定位点 ［6］ 。说明BFB周期引起染色体不断的变异，造成了癌基因的活化、扩增，抑癌基因的抑制及丢失。本研究研究分裂后期染色体桥现象在HNSCC细胞系分裂形态中高度表达，说明BFB周期在促进HNSCC染色体复杂演变，进而促进基因组变异，以至肿瘤的恶性的过程中起重要的作用。端粒作为线形染色体末端的基因元素，对维持染色体的结构和功能至关重要。所有真核生物的端粒都具有一相同的TTAGGG重复顺序。端粒对维持染色体结构起重要的保护作用。端粒保护功能失调可引起染色体双链的断裂，导致细胞长期处于G 1 期，促进细胞的衰老过程。而过度缩短的、不稳定的端粒又可造成染色体自身及相互之间的末端融合，形成双着丝粒染色体或环状染色体 ［3］ 。正常新生细胞均具有稳定的端粒表达，正如本研究正常对照组织早期细胞培养所示。但随着细胞的不断分裂，染色体端粒将不断缩短，甚至丢失 ［7］ 。而端粒酶，即端粒逆转录酶，与端粒始端结合，不断合成TTAGGG重复顺序，维持并延长端粒的长度。正常细胞的端粒酶活性处于抑制状态;而异常分化细胞或肿瘤细胞的端粒酶活性增高，促进端粒延长，稳定染色体结构，使癌细胞获得不断增殖的能力 ［8］ 。在本研究中，HNSCC细胞内染色体端粒均有不同程度的缺失，说明肿瘤端粒酶活化并不能足以完全维护染色体的稳定性。最新研究资料表明，端粒酶的活性与端粒的长度并不成正比。以往在表达端粒酶的侵袭性肿瘤研究中，同样也发现大量染色体末端TTAGGG重复顺序的缺失。然而，不容质疑的是端粒酶是促进癌细胞染色体不断变化发展、抑制细胞因分裂异常衰减的重要调节因子 ［9］ 。本研究中发现，HNSCC染色体端粒的缺失与癌细胞分裂后期染色体桥现象呈明显正相关，说明HNSCC染色体端粒功能失调，造成双着丝粒及环状染色体形成，促使癌细胞进入BFB周期。 通常染色体断裂、不稳定将导致细胞的衰老或凋亡。肿瘤细胞染色体端粒功能失调，BFB周期能够存在的先决条件是某些DNA检测、修复基因的功能受到抑制，允许含有断裂、不稳定染色体的癌细胞获得继续分裂、增殖的能力。如在胰腺癌BFB现象的研究中，同时发现变异的TP53基因表达 ［10］ 。

    总之，通过本研究，我们发现HNSCC染色体端粒功能失调促使癌细胞进入BFB周期，致使HNSCC染色体不断变异，进而导致大量基因失衡，即癌基因的活化、扩增，抑癌基因的抑制及丢失。相反这些基因改变又促进或维持了癌细胞染色体端粒缺失和BFB周期的继续存在。多种因素的相互作用最终导致HNSCC的恶性发展。

     4 结论

    HNSCC细胞中染色体末端端粒过度缩短或丢失，导致染色体间断裂和融合，形成双着丝粒或环状染色体，促使癌细胞进入BFB周期，致使HNSCC染色体结构不断变异，进而导致大量基因组改变，在HNSCC肿瘤发生、发展过程中起重要的作用。（本文图片见封三）

    1 Mc Clintock B.The production of homozygous deficient tissues with mu-tant characteristics by means of the aberrant behavior of ring-shaped chromosomes.Genetics，1938，23:215-376.

    2 Calvin B，Harley，Bryant Villeponteau.Telomeres and telomerase in ag-ing and cancer.Current Opinion in Genetics and Development，1995，5:249-255.

    3 Artandi SE，Chang S，Lee，et al.Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.Nature，2000，641-645.

    4 David Gisselsson.Chromosomal break-fuion-bridge events cause ge-netic intratumor heterogeneity.Pnas，2000，97:5357-5362.

    5 Fenech M，Crott JW.Micronuclei，nucleoplasmic bridges and nuclear buds induced in folic acid deficient human lymphocytes evidence for breakage-fusion-bridge cycles in the cytokinesis-block micronucle-us assay.Mutat Res，2002，504:131-136.

    6 Chernova OB，Chernov MV，Ishizaka Y，et al.MYC abrogates p53-mediated cell cycle arrest in N-（phosphonacetyl）-L-asparate-treated cells，permitting CAD gene amplification.Mol Cell Biol，1998，18:536-545.

    7 Harley CB，Fulcher AB，Greider CW.Telomeres shorten during ageing of human filbroblasts.Nature，1990，345:458-460.

    8 Harley CB，Kim NW，Prowse KR，et al.Telomerase，cell immortality，and cancer.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，1994，59:307-315.

9 Gisselsson D，JonsonT，Petersen A，et al.Telomere dysfunction triggers extensive DNA fragmentation and evolution of complex chromosome ab-normalities in human malignant tumors.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98:12683-12688.

    10 Lengauer C，Kinzler KW，Vogelstein B.Genetic instabilities in human cancers.Nature，1998，396:643-649.