应用血细胞分析仪Sysmex kx-21后复查血片的标准和程序

                            作者：许业栋，刘和录，杨小星，陈伟光

【关键词】  ,血细胞分析仪；血片；标准及程序

　　［关键词］ 血细胞分析仪；血片；标准及程序

　　Sysmex kx-21是日本东亚公司生产的三分类血液分析仪，比起以往的手工法血细胞分析，这种血液细胞分析仪性能优越，每小时可以检测60个标本，每个标本可提供18个分析参数以及细胞直方图，极大地提高了临床血液学检验的质量和工作效率，同时给临床鉴别诊断提供了足够的指标，但是它的分析原理仅仅是根据血液被溶血剂作用后细胞体积的大小将白细胞人为地分为三群：小型细胞群(WSCC)、中间细胞群(WMCC)和大型细胞群(WLCC)，小型细胞群相当于淋巴细胞，中间细胞群相当于嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞，大型细胞群相当于中性粒细胞。红细胞和血小板也是根据各自体积的大小来进行分群的，而传统的白细胞分类是指在显微镜下，观察经染色后的涂片，根据细胞形态(包括细胞体积大小、胞浆的颜色及量的多少、胞浆内所含的颗粒的多少及性质、核的形状、有无核仁及染色质的特点等综合分析)，得出准确均一的细胞群。此种仪器的所谓分类，只能起到过筛作用，它在鉴别血细胞的形态和结构等方面还很不完善，这样很容易造成漏检和误诊，耽误病情，甚至引起医疗纠纷。因此当白细胞数过高、过低，白细胞直方图异常及显示各种报警信号时，则应做涂片染色显微镜检查，经过确认、修正或补充后才能发出完整的检验报告。为此，我们根据实际经验和体会，对复查的标准和程序进行了初步的探讨。

　　1  复查的标准

　　对于应用血液细胞分析仪后复查血片的标准在现今的全国高等医药院校检验专业教材没有明确的论述，在《全国临床检验操作规程》里也未见有详细的说明。有人认为，三分类血细胞分析仪的血片复查应至少超过总标本数的10％，也有人认为当中间细胞群的百分率＞15％时才有必要复查血片，我认为这没有一点依据。美国罗马琳达大学医学院临床实验室镜检筛选条件是：WBC＜4.0×109/L或＞10.0×109/L、HGB＜100 g/L、单核细胞＞10%、淋巴细胞＞40％；仪器出现镜检建议(即Suspect Flags栏显示Blast、Imm Grans/Bands、NRBC、VariantLymphs)［1］。当前国内较普遍存在的看法是：每个实验室应根据自己的仪器设备状况、专业人员的技术水平以及实验室的其他条件等等来规定复查的标准。由于我们平时工作量大，觉得对每个标本都进行血涂片复查是没有必要的。对于各项分析参数都在正常范围之内，又无任何报警信号且各个直方图无特异性变化、患者又没有被怀疑或确诊为血液病时就完全可以不做血涂片显微镜检查而直接发出检验报告。根据我们多年以来使用Sysmex kx-21的经验，认为对于具有以下一种或一种以上情况要进行血涂片复查：临床怀疑或诊断为血液病患者时，或血液病患者经过需评估治疗效果时，或发热待诊患者，或肿瘤性疾病时，无论分析参数和血细胞直方图是否正常、是否有报警信号，均应进行血涂片的显微镜检查；当白细胞过高(＞15.0×109/L)或过低(＜3.0×109/L)时、血小板过高(＞1 000×109/L)或过低(＜10.0×109/L)时、红细胞过高(＞7.0×1012/L)或过低(＜1.0×1012/L)、血红蛋白过高(＞200 g/L)或过低(＜30 g/L)时；当有1个或1个以上的参数不能被检测出时；虽然能检测出所有参数，但仪器给出了异常的参数、警告信号时。以下是sysmexkx21血液分析仪可能出现的提示性信号或解释性信号*(表示该数据属线性保证范围外)、(表示该数据超过异常判定界限值的上限)；(表示该数据超过异常判定界限值的下限)、(表示该数据可靠性低)；+++．+(大大超过线性范围时)；WL(表示WBC下限鉴别线的相对度数超过规定值)：可认为是血小板聚集或含有多数大型血小板的原因；WU(表示WBC高辨别线UD的相对度数超过规定值)：高度怀疑溶血不充分(对于溶血剂的红细胞膜电阻极强的标本等)、或含有多数异常血球等的情况；T1(表示中性粒细胞下限鉴别线不能决定)；T2(表示中性粒细胞上限鉴别线不能决定)；F1(表示T1的相对度数超过规定值)：可能是小型白细胞分布异常；F2(表示T1或T2的相对度数超过规定值)：可能是中型白细胞分布异常；F3(表示T2的相对度数超过规定值)：可能是大型白细胞分布异常；RL(表示红细胞下限鉴别线的相对度数超过规定值)：可认为是噪声的影响、红细胞形态异常、血小板聚集等的原因；RU(表示红细胞上限鉴别线的相对度数超过规定值)：可认为是噪声的影响DW(表示分布幅不能算出)；MP(表示有2个以上的峰值)；PL(表示血小板下限鉴别线LD的相对度数超过规定值)：可初步认为是噪声的影响；PU(表示血小板上限鉴别线UD的相对度数超过规定值)：可认为是血小板聚集或噪音的影响；仪器给出了异常的直方图时，如白细胞直方图上有异常增多的小型细胞群、中间细胞群或大型细胞群图形时，红细胞直方图有左移、右移或出现双峰时，血小板直方图出现尾部不规则、拖尾、上翘、分布不均匀时。白细胞直方图上小型细胞群左侧区域出现异常提示可能有血小板聚集、巨大血小板、疟原虫、有核红细胞、未溶解红细胞、蛋白质或脂类颗粒，中间细胞群区域出现异常提示可能有异型淋巴细胞、浆细胞、非典型细胞、原始细胞、白血病细胞、嗜酸性粒细胞增多、嗜碱性粒细胞增多、未成熟的中性粒细胞、异常细胞亚群，大型细胞群右侧区域异常表示中性粒细胞绝对值增多，若出现多部位报警表示同时存在2种或2种以上的异常。若标本中有大血小板或小红细胞、红细胞碎片、聚集的血小板等干扰时，血小板直方图可异常。当红细胞体积大小发生变化如有大量巨大血小板或小红细胞的存在，或大小不一的红细胞同时存在时，红细胞直方图可左移、右移或出现双峰。

　　2  复查的内容

　　从事血片复查的工作人员，应受过良好的专门训练，具备血液细胞形态学基础知识、丰富的临床经验，对血液分析仪Sysmex kx-21十分熟悉，特别是掌握各种细胞直方图的正常和异常图形，以及各种警告信号可能包含的意义，并能对这些意义进行解释和评价。血涂片复查的内容应包括观察各种细胞形态，如红细胞、白细胞、血小板及血小板、红细胞有无聚集，有无异常形态的细胞，有无寄生虫等，还要估计这些细胞数量是否与血细胞分析仪检测出的数值一致。

　　3  复查的程序

　　首先要使仪器每天都保持在最佳状态每8 h要做一次质控分析，试剂特别是溶血剂要与仪器配套使用，以免人为的误差增大技术人员的工作强度，造成不必要的麻烦。对要复查的标本最好是静脉抽血防止毛细血管采血可能造成的组织液混入而使血细胞各项指数偏低或标本凝固，特别是对血小板的影响。静脉采血法能获得具有代表性的血细胞检查结果，所以现在我们是强烈要求对所有血常规标本都需行静脉采血，但静脉抽血应尽量避免溶血，以防止红细胞和血细胞比容减低。要避免用肝素做抗凝剂以防红细胞和血小板的计数结果受到影响。标本采集后应及时测定最好在2 h内完成，不宜在冰箱内存放，否则对白细胞分类影响很大。对要复查的标本立即推成厚薄适宜的血涂片，头、体、尾三部分清晰可见，天气寒冷或潮湿时应于37 ℃温箱中保温促干，以免细胞变形缩小，瑞氏染色待检。将干燥后的血涂片置显微镜下观察，用低倍镜或高倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞，了解血涂片染色和细胞分布情况、有无血小板或红细胞聚集成串或成堆。体积较小、密度较大的淋巴细胞，在体部较多，而体积较大、密度较小的单核细胞和粒细胞在尾部和两侧较多，异常大的细胞则常出现在尾部。用油镜观察各种细胞的形态，并估计其数量。如果白细胞计数、分类和(或)白细胞直方图异常，首先观察血涂片，看白细胞数量是否与仪器计数一致，白细胞总数与血涂片上白细胞分布密度的关系，见表1。如不一致，应找原因，是否仪器不正常，或是否标本本身的原因：一般地说，抗凝不充分、外周血出现有核红细胞、巨大血小板、血小板聚集等均可影响血细胞分析仪对白细胞计数的测定。这时需对结果加以校正，如使用传统的牛鲍氏计数盘等。若受有核红细胞的影响，可用下列公式加以校正：校正后白细胞数／L=(100/100+有核红细胞数)×校正前白细胞数。观察血涂片的重点内容是白细胞形态，一般地说至少要分类100个～200个白细胞，白细胞总数与分类白细胞数量的关系，见表2。浏览血片时，要按的移动视野，一般以”弓”字形进行，避免重复或遗漏，避免主观选择，同时也要兼顾两侧和尾部，因为异常或巨大的细胞可能就在两侧或尾部。外周血常规白细胞分类中，是将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，而在Sysmex kx-21血细胞分析仪中，只要求将白细胞分为三类，即小型白细胞群、中间型细胞群和大型细胞群，所以进行白细胞分类时就一定要分清楚这三类细胞群都包括哪些细胞。有时为了协助血液病和其他疾病的诊断，临床医生还要求对中性粒细胞进一步细分为分叶核细胞、杆状核细胞、晚幼粒细胞、中幼粒细胞等，以及血涂片内的异常细胞的情况包括：细胞的大小、核质的比例、核的大小、核的形状、核的染色质结构、核染色质受色情况、核膜、核仁的有无和多少、胞质量、胞质颜色、胞质颗粒等。在严重化脓性细菌感染、败血症、恶性肿瘤、急性中毒、大面积烧伤等病理情况下还要注意观察中性粒细胞的毒性变化如细胞的大小不均、毒性颗粒、空泡变性、杜勒氏小体、细胞退行性变以及中性粒细胞的核象变化如核左移、核右移、巨多核、巨杆状核、过分叶核、PelgerHuet畸形、双核、环形核、ChediakHigashi畸形、AlderReilly畸形、MayHegglin畸形等。在病毒感染时还要注意观察异型淋巴细胞的情况。对于某些难以鉴别的细胞可能还需要用显微镜形态学、细胞化学染色或免疫组织化学染色来确定。

　　表1  白细胞总数与血涂片上白细胞分布密度的关系（略）

　　表2  白细胞总数与分类白细胞数量的关系（略）

　　血涂片染色显微镜复查的另一个方面就是红细胞系统，如果患者患有贫血、感染或其他血液病时，其红细胞数量、血红蛋白浓度、红细胞比积及相关的指标(如MCV、MCH、MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW)、直方图等都会出现1个或1个以上的参数异常，这时要着重观察红细胞的大小、形态、内含物、着色性、大小一致性以及有无有核红细胞等，血液中白细胞显著增高也可影响红细胞计数，高脂血症可使血红蛋白假性升高，进而导致MCH和MCHC的测定偏差，M蛋白增多时可与溶血剂发生反应使血红蛋白结果偏高，在低色素贫血或红细胞内含有大量HbS或HbCO、某些新生儿或某些肝病患者红细胞膜脂类异常等都具有抵抗溶血剂作用，导致红细胞溶血不完全。如有异常，应加以描述并报告。常见的异常红细胞形态有：多嗜性红细胞、网织红细胞、点彩红细胞、嗜碱性红细胞、红细胞中心浅染、Cabot环、红细胞大小不均、球性红细胞、椭圆形红细胞、泪滴形红细胞、盔形红细胞、异形红细胞如盔甲状、豆状、梨状、蝌蚪状、月牙状和麦粒状以及锯齿形红细胞、棘形红细胞、皱缩红细胞、口形红细胞、镰状红细胞、靶形红细胞、裂片红细胞、红细胞缗钱状排列、新月形红细胞、HowellJolly小体、铁粒幼红细胞和铁粒红细胞、Heinz小体等，有些异常红细胞可能还要经某些化学染色或组化染色才能鉴别。由于血液在体外储存过久或涂片时的其他技术原因，有时血片的局部区域可能出现一些假的靶形红细胞、口形红细胞和假的球形红细胞等，缺乏经验的检验者，往往会将其当作真正的异形红细胞。最简单的鉴别方法有：浏览涂片的其他区域，如果是真的异形红细胞，全片(而不是个别区域)都可见到同样的异常；重新采集标本，涂片染色镜检［2］。血涂片染色显微镜复查还有一个方面就是血小板，我们在运用Sysmex kx-21血液细胞分析仪最常见到的血小板分析异常就是血小板不显示分析参数和(或)图形异常。在一般情况下这些异常都是因为标本采集(毛细血管采血法)导致的血小板聚集及血小板减少造成的。所以在血小板数目及直方图、血小板平均体积(MPV)异常、血小板分布宽度(PDW)增加时则需浏览血片，首先估计血小板数量。Williams血液学第六版(2001)叙述：正常情况下，在血片厚薄适中区域(每个红细胞彼此相互接触但双不重叠)，每个油镜视野，约有血小板8个～15个；或每10个～30个红细胞见到一个血小板。当然，这只是一个大致的估计。根据我们的经验，只要平时留心观察，并积累一定经验之后，通过浏览血片，大致估计血小板数并不太困难。与此同时，注意观察血小板的形态。在瑞氏染色的血片上，正常血小板为圆形或卵圆形，直径1 μm～4 μm，胞质无色或淡蓝色，浆内含少许红色颗粒，有时会误认为是核。血小板大小相差悬殊，巨型血小板可达红细胞样大，胞质蓝色加深。由于在不少血小板减少性疾患、血栓性疾病、心血管疾病以及遗传性巨大血小板病等，大血小板会增多；故发现大血小板增多时应予报告。在观察血小板形态的同时，还应观察有无血小板聚集现象，如各种病因引起的血栓前状态使血小板易于聚集。血小板聚集需要钙离子，因此，用除钙的EDTA抗凝涂片时，血小板分散较好，一般不会发生聚集。同时，血小板会略微肿胀，颜色也较皮肤穿刺血片略淡，但有极少数患者的血小板在EDTA抗凝血液中反而会发生聚集，造成血小板计数假性降低。此时应改用其他抗凝剂(如枸橼酸钠)或手工计数，这种现象可能与患者存在依赖EDTA的抗血小板自身抗体有关［3］。还要注意某些病理因素对血细胞分析仪的影响如多友性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淋巴系统增殖性疾病、转移瘤、自身免疫性疾病、感染及某些原因不明疾病的患者含有冷球蛋白或骨髓瘤、癌症、白血病、妊娠、血栓疾病、糖尿病患者血中存在冷纤维蛋白，可使血液中非晶体物质聚集，因而导致血细胞计数值增高。此时将稀释标本放在37 ℃水浴，10 min后立即计数可消除此影响。总之，血涂片的显微镜检查是血细胞形态学检查的基本方法，也是血细胞形态学诊断的依据，在临床上应用极广，仔细观察一张染色和制备良好的血涂片能够获得大量有关患者病情的信息，有助于疾病的诊断。许多疾病时患者的血细胞计数在正常范围内，但其细胞形态异常。如果血涂片制作或染色不佳，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误的结论。因此，熟练的血涂片制作和染色技术是血细胞形态学检查的前提条件，同时要求检验者熟悉显微镜下正常和病理状态下的细胞形态。当显微镜观察与仪器结果差别太大时，应根据情况重复测定并报告显微镜形态观察结果，或重复采血复查［4］。

　　4  小结

　　由于目前国内应用的三分类血细胞分析仪是根据白细胞体积大小分类，不能区分嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞及幼稚细胞，更不能识别异型淋巴细胞和有核红细胞及中性粒细胞毒性病变等等。一些小粒细胞可当作淋巴细胞或中间细胞，大淋巴细胞可当作粒细胞计数。还有一些成团血小板，巨型血小板可当作淋巴细胞或白细胞计数。一般情况下，如果白细胞计数很高(＞15×109/L)，白细胞直方图100 fl～150 fl出现高尖峰，这种情况一般都很重视而不易漏诊，而对一些白细胞计数正常或略偏高或略偏低又不进行血涂片染色分类就很容易误诊。某些基层的一些医生和检验人员由于基础知识缺乏。只求效益不求医疗质量，不重视血涂片显微镜检查而经常耽误甚至造成医疗事故。由此可见我们作为一个检验工作者，一定不能忽视血涂片染色的显微镜检查，只有综合血常规、显微镜检查、其他实验室检查结果和临床表现等才能对某些感染、贫血和其他血液病作出明确的诊断。我认为，目前的三分类血细胞分析仪只能用作筛选，有条件的医疗单位要逐步淘汰三分类血细胞分析仪、更适合于临床的可自动涂片染色等的全自动五分类血细胞分析仪。以上仅仅是笔者粗略的叙述了一些，还望在检验专业教材里有明确的规定：应如何制定血涂片复查的标准、内容、方法和程序，在哪些情况下需要做血涂片染色复查，在哪些情况下没有必要做血涂片复查。

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　　［1］  戴泽宁，金红.血细胞分析仪应用中镜检标本筛选条件的探讨［J］.检验医学，2004，4：366.

　　［2］  李影林.中华医学检验全书［M］.北京：人民卫生出版社，1996：276293.

　　［3］  朱晓辉，何菊英，朱忠勇.利用血液分析仪后复查血片的内容和方法及程序［J］.中华检验医学杂志，2003，12：785787.

　　［4］  刘金玲.应用多参数血细胞分析仪必须同时涂片染色分类［J］.中原医刊，2001，7：63