微柱凝胶法在新生儿溶血病IgG抗体效价检测中的应用及方法学探讨

【摘要】  目的：探讨微柱凝胶法在新生儿溶血病实验诊断中测定孕妇血清中IgG抗体效价的可行性及方法学。方法：孕妇血清用2-Me处理做倍量稀释后，采用微柱凝胶法测定IgG抗体效价。同时与试管法进行对照比较。结果：用微柱凝胶法和试管法同时检测孕妇血清中的IgG抗体效价，其结果符合率为84．5％(93／110)，其中IgG抗体效价<64时符合率为85，4％(70／82)，IgG抗体效价≥64时符合率为82．1％(23／28)。两种方法检测孕妇血清IgG抗体效价结果差异无显著性(P>0．05)。结论：应用微柱凝胶法测定孕妇血清IgG抗体效价，能够使实验方法简单化、自动化，使实验操作标准化，判读结果直观、与试管法相比减少了肉眼判读结果时的人为误差。方法灵敏度高，结果准确可靠。

【关键词】  微柱凝胶法；IgG抗体效价；方法学

　　1  材料与方法

　　1．1  检测对象  2005年8月至2006年9月在本院门诊围产保健及住院待产的孕妇110例，年龄在23周岁～35周岁，孕妇ABO血型均为O型，且丈夫血型为A型、B型或AB型。

　　1.2  实验仪器及试剂  DiaMed-ID卡式血型配血系统(ID-Centrifuge 12 SⅡ离心机和ID-Incubator 37 SⅠ保温孵育器购自瑞士达亚美公司)，达亚美Liss／coobs卡，抗人球蛋白试剂(购自上海血液生物医药有限责任公司)。

　　1．3  检测方法

　　1．3．1  采用微柱凝胶法对受检孕妇血清进行IgG抗体效价测定  抽取受检孕妇血标本5 ml，置37 ℃水浴10 min，离心分离血清与红细胞。取试管一支，加受检孕妇血清0．2 ml及2-me试剂0．2 ml，混合加塞，置37 ℃水浴30 min进行处理，以充分破坏血清中的IgM类抗体。另取6支干净试管，置于试打架上，第一支试管加处理后的血清50 μl和盐水350 μl混匀。第2支至第6支试管分别加入200 μl盐水。从第1支试管中吸取200  μlul液体加入第2试管中混匀，再从第2支试管中吸取200 μl液体加入第3支试管中混匀，依次倍量稀释(第1管～第6管稀释倍数依次为1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512)。取达亚美Liss／coombs卡(一卡六管)一张，撕去铝箔，6管中各加父亲1％红细胞悬液50 μl。从第1支～第6支试管中各取25 μl液体分别加入达亚美Liss／coombs卡的6管中。将加好样的达亚美Liss／coombs卡置于ID-Incubatre 37 SⅠ保温孵育器内，孵育15 min，将孵育好的Liss／coombs卡置ID-Centrifuge 12 SⅡ离心机内离心15 min。判读结果：出现1+的最高管稀释度的倒数即为IgG抗体效价。

　　1．3．2  采用试管法对同一受检孕妇血清进行IgG抗体效价测定  取干净试管8支置于试管架上，分别加入200 μl盐水，第1支试管加入上述处理过的血清200 μl混匀，从第1支试管中吸取200 μl液体加入第2支试管中混匀，再从第2支试管中吸取200 μl液体加入第3支试管中混匀，依次倍量稀释。其余操作步骤按照《全国临床检验操作规程》一书中的IgG抗A(B)测定进行［1］。

　　2  结果

　　2．1  两种方法检测  对2005年8月至2006年9月在我院围产保健及住院待产的110例孕妇血清IgG抗体效价用微柱凝胶法和试管法同时检测，其检测结果见表1。

　　表1  110例孕妇血清IgG抗体效价两种方法检测结果(略)

　　2．2  采用微柱凝胶法  测得110例孕妇血清IgG抗体效价结果与试管法比较，结果符合率为84．5％(93／110)，其中IgG抗体效价<64时结果符合率为85．4％(70／82)、IgG抗体效价≥64时结果符合率为82．1％(23／28)。两种方法测定所得结果经统计学处理，微柱凝胶法IgG抗体效价几何均值为29．7，试管法IgG抗体效价几何均值为28．8。两种方法检测孕妇血清IgG抗体效价结果差异无显著性P>0．05(轶和检验)。

　　3  讨论
　　
　　微柱凝胶试验是红细胞膜抗原与相应抗体在凝胶介质中发生的凝集反应，是一种免疫学检测技术［2］。微柱凝胶分中性胶、特异性胶和抗人球蛋白胶，本试验是用抗人球蛋白胶检测IgG不完全抗体和相应红细胞抗原的反应。本研究应用微柱凝胶法在HDN实验诊断中检测孕妇血清中IgG抗体效价，其检测结果与试管法检测结果一致。但试管法测定血清中IgG抗体效价时操作程序复杂，需要对红细胞经过反复洗涤后加入抗人球蛋白试剂观察凝集现象，洗涤费时，结果判断时人为因素干扰较大。而微柱凝胶法是通过调节凝胶的浓度来控制凝胶间隙的大小，使其间隙只能允许游离的红细胞通过，从而使游离的红细胞与聚集红细胞分离，通过离心，红细胞沉积在凝胶带下部，则表明红细胞未发生凝集，呈阴性反应。若红细胞聚集在凝胶带上部，则表明红细胞发生凝集，呈阳性反应。该方法具有操作简单化、自动化、实验方法标准化、重复性好、一卡6管，避免错误、结果直观，便于判读等优点。应用微柱凝胶法测定IgG抗体效价比试管法的灵敏度更高，结果更可靠。该方法逐渐应用于血型鉴定、交叉配血、抗体筛查与鉴定等血型血清学检查中［3，4］。我们在应用微柱凝胶法检测血清IgG抗体时，分别应用加热和2-Me或DTT对血清中IgM抗体进行灭活处理，其灭活效果相当。尤其是应用加热方法处理血清IgM抗体，其灭活效果更佳，结果更稳定。用加热方法处理血清中IgM抗体，血清先用生理盐水4倍稀释，温度严格控制在68 ℃～70 ℃，时间控制在3 min。温度过低，血清中IgM抗体处理不完全，影响IgG抗体效价测定结果偏高。温度过高会引起所有血清蛋白变性。用DTT处理血清IgM抗体时也应掌握好时间，过分用DTT处理血清会引起所有血清蛋白变性。

【】
  　　［1］ 叶应妩，王毓三．全国临床检验操作规程［M］．第2版．南京：东南大学出版社，1997：110?111．

　　［2］ 李勇，杨贵贞．人类红细胞血型学实用理论与实验技术［M］．第1版．北京：技术出版社，1999：276?278.

　　［3］ 李勇，朱逢春，刘莹，等．微粒凝胶coombs试验对人RhD血型检测的实验研究［J］．中国输血杂志，1998,11(1)：24.

　　［4］ 李沙，郑山根，欧阳锡林，等.微柱凝聚技术筛检不规则抗体的初步观察［J］．中国输血杂志，1999,12(3)：168.