酶联免疫吸附试验影响HBsAg常见因素与对策

【关键词】  酶联免疫吸附试验 表面抗原 常见因素

　　Common Factors of Influencing HBsAg and Countermeasure in ELISA

    酶联免疫吸附试验(enayme liked immunosorbent assay ELISA)是一种常用的固相酶免疫测定法。ELISA的基本原理是：使抗原(或抗体)结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；使抗原(或抗体)于某种酶联结成酶标抗原(或抗体)而且比酶标抗原(或抗体)既保留其免疫活性，又保留其酶活性；测定时将待测标本(抗原或抗体)和酶标抗原(或抗体)按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例，再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。

    ELISA方法被广泛用于各种抗原与抗体的测定。但ELISA测定中影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，出现错误的结果。所以有必要对ELISA测定操作中可能出现的问题及其解决办法加以探讨，以免引起不必要的医疗事故及纠纷。

　　1  试剂的选择

    要选用认证的试剂，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂，不要混用不同批号的试剂，更不可使用过期试剂。试剂盒及待测标本所需微孔37℃平衡30 min后方可使用，其余者应封存在冰箱备用。

　　2  标本因素

    标本应在新鲜时检测。如有细菌污染也会产生假阳性。一般说来在5 d内测定的血清标本可放置于4℃，超过1周测定，则应冷冻于-20℃以下，避免反复冻融。使用前恢复到室温，轻轻晃动摇匀。另在临床检验工作中，为争取时间快速检测，在血液还未开始凝固时强行离心分离血清，此时血清中仍残留部分纤维蛋白丝就会附着与微孔底部干扰抗原抗体反应，影响结果。溶血标本红细胞溶解会释放出具过氧化物酶活性物质，可能会增加非异性显色。故应用正确来血技术恢复全血标本，37℃静置1 h，离心分离提取血清用于检测。在一步法中，当标本中受检抗原含量很高时，过量抗原分别与固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成“夹心复合物”，如按常规测读所得结果将低于实际含量，被称为钩状效应，严重时甚至可不显色而出现假阳性。因此使用一步法测定标本中含量可异常高物质如HBsAg应注意可测范围最高值，用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。对RF(+)者标本及酶标抗体用1.6%小牛血清稀释后再做。

　　3  操作中存在的问题及处理方法

　　3.1  加样 

　　加样要准确，滴加试剂时应垂直滴加，不得倾斜、人为的加大试剂量。另做到一人一移液头，防止交叉污染。加标本应加在微孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

　　3.2  温育 

　　温育时间应按规定力求准确。温箱温度必须严格控制。温育过程中应封闭，避免边缘效应。

　　3.3  洗板
 
　　洗涤在ELTSA过程中虽不是一反应步骤，但却也决定着实验的成败，除配有洗板仪外手工操作有侵泡式和流水冲洗式，洗板要彻底，洗液应注满每孔，甩板时要垂直，避免交叉污染并且用力不能过猛，防止冲掉抗原抗体复合物，造成假阴性，其次洗板次数不可太多。洗板机洗板时每天进行注液量和残液量的校正，使用完毕后用蒸馏水冲洗。洗涤时确认注满每个反应孔，洗涤后残液量不得>2 μl，最后将孔内液体拍干。

　　3.4  显色 

　　显色时间应严格按操作规程作。

　　3.5  终止 

　　显色终止15 min内酶标仪读取，酶标仪不应置于阳光或强光照射下，先预热15 min～30 min再进行测试。

　　3.6  质控 

　　每批测试均应做好质控，建立严格的审核制度，对检验结果判断是否准确，可靠有效，异常结果复查与临床医生及时沟通，对室间质评结果分析处理，找出失控原因及再控经验。

    在实际操作中，须严格按试剂盒内说明书进行实验操作，控制每步反应时间，操作紧凑，做好以上所有环节，就能保证HBsAg检测结果的准确性。

【】
  　　［1］陶文训.免疫学和免疫学检验［M］.北京：人民卫生出版社，1989：144.

　　［2］王秀芳.影响LvcY-2型化学发光仪结果的常见因素与对策［J］.检验医学杂志，2007，22：43.