2-甲氧基雌二醇对原代骨髓瘤细胞分化的作用
【摘要】 本研究观察2-甲氧基雌二醇对多发性骨髓瘤患者原代细胞诱导的分化作用。 采用CD138+磁珠分离纯化7例骨髓瘤患者原代骨髓瘤细胞，通过形态观察、细胞表面标志分析和细胞分泌轻链蛋白的情况，观察2-甲氧基雌二醇对多发性骨髓瘤原代骨髓瘤细胞分化的影响。 结果表明： 患者原代骨髓瘤细胞经0.5 μmol/L 2-甲氧基雌二醇分别作用36及72小时后，细胞形态向成熟阶段，表现为细胞胞核缩小，胞浆丰富，核浆比例下降，核仁减少或消失，核染色质变粗、变密。 CD49e阳性细胞率由（11.02±1.75）%（DMSO对照组）增加到（23.80±1.62）%(36小时组)及（35.68±1.85）%(72小时组)，差异具有统计学意义(P<0.05)； 细胞分泌轻链蛋白由（225.7±30.4）ng/ml（DMSO对照组）升高到（296.7±18.8）ng/ml(36小时组)及（37 8.9±1 5.8）ng/ml (72小时组)，差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论： 较低浓度2-甲氧基雌二醇可诱导骨髓瘤患者原代骨髓瘤细胞向成熟阶段分化。
【关键词】 2-甲氧基雌二醇
Effect of 2-Methoxyestradiol on Differentiation of Primary
Myeloma Cells
Abstract In order to investigate the differentiation-inducing effect of 2-methoxyestradiol (2ME2)，an estrogen derivative，on CD138+ (Syndecan-1) primary myeloma cells from 7 patients with myeloma，primary myeloma cells from 7 patients were enriched by using CD138 immunomagenetic beads.The enriched CD138+ (Syndecan-1) myeloma cells treated with 0.5 μmol/L 2ME2 for 36h and 72 hours were used to observe the differentiation changes with expression of CD49e and to quantitatively detect the light-chain secretion in the supernatants. The results indicated that 2ME2 caused morphological and immunophenotypic changes with light-chain secretion in the supernatant，and the typical features of differentiation of CD138+ (Syndecan-1) primary myeloma cells.CD138+ (Syndecan-1) myeloma cells became more and more mature in morphology，with decreased ratio of nucleus to plasma，disappearance of nucleoli，and pyknosis of chromatin.The result of detecting the expression of CD49e of CD138+ (Syndecan-1) myeloma cells showed the obvious up-regulation of CD49e expression after exposure to 2ME2 for 72 hours. Quantitative assay for light chain secretion in the supernatant of bone marrow CD138+ cells from patients showed remarkable increment at 72 hours. It is concluded that lower concentrations of 2-methoxyestradiol can induce differentiation of bone marrow CD138+ cells from multiple myeloma patients.
Key words 2-methoxyestradiol; cell differentiation; myeloma; primary cell
肿瘤的发生主要是由于恶性细胞不断异常增殖、凋亡受阻及细胞向成熟阶段分化阻滞所致。现行的肿瘤方案也多采取化疗药物来阻止恶性细胞异常增殖，诱导恶性细胞凋亡及分化［1，2］。多发性骨髓瘤（MM）是发生在B细胞分化终末阶段，即浆细胞阶段的肿瘤，现行的治疗方案尚不能治愈MM ［3］。而大多数化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤了机体的正常细胞。因此，寻找有效的分化诱导剂，在MM的治疗中具有重要的意义。我们先前的研究已证实2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2ME2)在低剂量时具有诱导骨髓瘤细胞株分化的作用，但其对于骨髓瘤患者的原代骨髓瘤细胞是否具有分化作用尚未见报道。我们以我科室收治的骨髓瘤患者原代骨髓瘤细胞为研究对象，初步探讨2-ME2对于患者骨髓瘤原代细胞体外分化作用的影响。
材料和方法
研究对象
本科门诊及病房收治的MM患者7例，均符合诊断标准［4］，其中男性4例，女性3例，年龄37-70岁，中位年龄55岁。7例患者中IgG型3例，IgA型1例，IgD型及λ轻链型各1例，κ轻链型1例，均为Ⅲ期患者。这些患者的基本资料见表1。Table 1. Basic data of patients with multiple myeloma（略）
主要试剂
2-ME2购自美国Sigma公司，其相对分子质量为302.4，取二甲亚砜（DMSO）配制成1 mmol/L原液(取1 mg 2-ME2，溶解于3.3 ml DMSO中) 4℃保存，实验前用RPMI 1640液稀释成所需浓度。DMSO在培养体系中的终浓度小于0.1%，在此浓度时对细胞并无明显影响。鼠抗人CD49e抗体，PE标记的兔抗鼠二抗购自深圳晶美公司。Human Kappa-b&f ELISA 定量试剂盒 和 Human Lambda-b&f ELISA 定量试剂盒购自Bethyl Laboratories Inc，USA。CD138磁珠、LS+ 型MACS 分选柱购自德国Miltenyi Biotec公司。酶标仪为德国BIO-RAD公司产品。
细胞CD138+磁珠分离纯化鉴定及培养
抽取MM患者的骨髓液15 ml，常规肝素抗凝，PBS洗液稀释新鲜骨髓，分装于50 ml 离心管中，用淋巴细胞分离液于400×g离心20分钟收集单个核细胞层，用PBS 在4℃、1 000×g离心10分钟洗涤1 次，弃上清，加PBS洗液200×g离心10分钟，洗2 次，弃上清。将MiniMACS 分离柱(LS+型) 置于带永久性磁场的分离器上，以500 μl 缓冲液洗柱后，将细胞悬液加于柱顶，使其缓缓通过分离柱，以500 μl 缓冲液洗柱4 次，洗脱去除CD138-细胞后，将分离柱移出磁场，加1 ml缓冲液于柱顶，加压使CD138+细胞洗脱下来，收集CD138+细胞并进行计数。经流式细胞仪检验富集后细胞99％以上为浆细胞，用台盼蓝拒染法检测细胞活力均在95％以上。然后用含体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养液（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）调整细胞数至1.0×106/ml，将细胞培养在含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液内，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。
细胞形态学观察
将药物处理后的细胞离心收集并制成细胞涂片，晾干。瑞氏染液与蒸馏水按1∶1的比例混合，对涂片进行染色5分钟，以自来水冲洗，干燥后，光镜下观察，同济亨特成像系统拍照，存档。
CD49e抗原表达
以0.5 μmol/L 2-ME2较低剂量于36小时及72小时处理。实验分组如下： ①DMSO对照组（与0.5 μmol/L 2-ME2组所含DMSO浓度相同）；②36小时2-ME2组；③72小时2-ME2组。收集上述经处理后的细胞（台盼蓝染色，细胞存活率均在95%以上)，用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS，pH 7.4)洗涤1次，调整细胞浓度至1×106/ml；加入流式细胞仪专用的分析试管，每管100 μl；再分别加入标记缓冲液（PBS+1% BSA+0.02%叠氮钠）稀释的鼠抗人CD49e抗体（一抗），标记浓度为5 μg/ml，4℃标记30分钟；PBS洗涤2次后加入PE标记的兔抗鼠二抗，每管20 μl，二抗标记浓度为20 μg/ml，置暗处4℃下标记30分钟，PBS洗2次，标记的细胞通过流式细胞仪，检测细胞表型，各样本同时以无关同型Ig亚类为阴性对照。用FACScanTM流式细胞仪及Cellquest 1.2软件获取并分析10 000个细胞。最后结果为各实验组值减去相应阴性对照值。实验设复孔3个，实验重复3次。
细胞培养上清免疫球蛋白测定
收集经药物作用后的细胞悬液，离心，收集细胞培养上清液，采用Human Kappa-b&f ELISA定量和Human Lambda-b&f ELISA定量试剂盒检测细胞培养上清免疫球蛋白，严格按照说明书操作，实验重复3次。方法简述如下：取羊抗人κ或λ单克隆抗体，用0.125 mol/L （pH 9）碳酸盐缓冲液稀释成10 mg/L，包被聚苯乙烯酶标板，每孔100 μl，于4℃包被0.5小时，用蒸馏水洗涤3次。以含1% 牛血清白蛋白，0.05% Tween-20，0.4 g/L叠氮钠，pH 7.4 PBS封闭1小时，然后用蒸馏水洗涤3次，吸干。包被后的酶标板用胶纸封好放4℃冰箱保存。测定时从冰箱中取出包被好的酶标板，放室温30分钟。加100 μl标本，37℃水浴15分钟，洗涤，吸干。加200 μl 辣根过氧化物酶标记羊抗人κ或λ单克隆抗体的酶标抗体(以Tris，pH 7.3，含1 g/L牛血清白蛋白缓冲液稀释的过氧化物酶标记抗体)。37℃水浴15分钟。加200 μl含邻苯二胺4 mg、pH 5.0醋酸缓冲液10 ml，30% H2O2 10 μl的底物。37℃水浴10分钟。以2 mol/L H2SO4 50 μl终止反应。根据标准曲线得κ或λ浓度。
统计学分析
采用SPSS 10.0统计处理软件分析，结果以±SD表示。
结 果
2ME2作用后患者原代骨髓瘤细胞形态的改变
未经2ME2作用的原代骨髓瘤细胞形态比较原始，胞浆少，核浆比例大，有些细胞可见明显的核仁，核染色质致密。以0.5 μmol/L 2ME2处理36小时后即可见到细胞胞核缩小，胞浆丰富，核浆比例下降，核仁减少或消失，核染色质变粗、变密。这表明在形态学上细胞已明显向成熟。随着时间的延长，2ME2对原代骨髓瘤细胞形态学的作用更加明显，细胞具有典型的碱性胞浆，胞浆丰富。有些细胞出现胞核偏心，核染色质粗糙，凝聚成块状，着色深，排列成车轮状，呈现成熟浆细胞特有的形态改变，它有别于细胞凋亡的早期形态学改变（1、2、3）。而此时经原位缺口末端标记（TUNEL）方法检测，细胞并未出现凋亡的特征性改变。这说明分化剂量对于骨髓瘤细胞并无诱导凋亡作用。
2-ME2作用后对骨髓瘤细胞表面分化抗原表达的影响
经0.5 μmol/L 2-ME2处理后，7名骨髓瘤患者CD138+细胞表面平均CD49e阳性细胞率较DMSO对照组明显增高，而且呈现时间依赖性改变，0.5 μmol/L 2-ME2作用36小时后CD49e阳性细胞率为（23.80±1.62）%，0.5 μmol/L 2-ME2作用72小时更明显，CD49e阳性细胞率增加到（35.68±1.85）%，差异有统计学意义(P<0.05)（表2）。这说明低剂量2-ME2诱导细胞表面分化抗原表达呈现时间依赖性改变。Table 2.Changes of light chain secretion and expression of CD49e of CD138+ cells （略）
2-ME2作用后细胞分泌轻链蛋白量增加
0.5 μmol/L 2-ME2处理36小时后，7名骨髓瘤患者CD138+细胞分泌轻链免疫球蛋白量明显地高于DMSO对照组，分别为（296.7±18.8）ng/ml 和 （225.7±30.4）ng/ml，（P＜0.05）。0.5 μmol/L 72小时组细胞分泌轻链免疫球蛋白量较36小时组也有明显的增高，分别为（356.8±18.5）ng/ml 和 （296.7±18.8）ng/ml，（P＜0.05）（表2）。这说明较低剂量2ME2诱导骨髓瘤患者原代细胞分泌轻链蛋白也呈现出时间依赖性增加的趋势。
讨 论
免疫磁珠是包被有单克隆抗体的磁性微粒，它可与含有相应抗原的细胞结合。结合有靶细胞的磁珠在通过磁场时可被滞留，从而与其他成分分离，达到纯化富集的目的，该过程称为免疫磁性分离。从目的细胞的收获方式可分为两种，即阳性分离和阴性分离。Miltenyi等［5］于1990 年建立了磁性细胞分离系统(MACS)，所用磁珠的直径仅为30-60 nm，对细胞活性几乎没有影响，分选后的细胞不需要去除磁珠，可直接进行细胞培养，而不影响细胞的增殖、分化，并且分离纯度可高达95%-99%，因此得到广泛地应用。CD138又名Syndecan-1，属于黏附分子整合蛋白跨膜黏结蛋白聚糖家族成员，通过其分子表面的硫酸肝素侧链可结合一系列配基，如细胞黏附分子、基质成分、生长因子、酶和酶抑制物等，以共受体方式调节细胞与微环境之间的相互作用，参与组织器官分化发育、血管形成、组织再生等一系列生理过程的调节［6］。对于人B 细胞，Syndecan-1的表达与B细胞和细胞外基质相互作用的时间和部位有关:前B细胞表达Syndecan-1分子，而成熟B细胞一旦释放入外周血循环，CD138分子则缺失;当成熟B细胞在外周淋巴组织分化为浆细胞时，细胞又重新表达［7］。已经证实CD138为浆细胞特有的免疫标志，世界上多采用CD138作为抗体分选浆细胞［8］，为此我们选用CD138阳性选择法分离纯化骨髓瘤患者原代浆细胞。
过去一直认为骨髓瘤细胞是由正常浆细胞恶性转化而来。随着免疫学和分子生物学的进展，对骨髓瘤的细胞起源有了新的认识。众多研究结果证实，MM患者外周血和骨髓中存在前体B细胞。当B淋巴细胞在抗原刺激下分化为浆细胞时失去B细胞的相关抗原，如HLA-DR、CD19、CD20，并获得浆细胞的特有抗原，如CD38［9］；在浆细胞进一步分化过程中再逐步失去CD45和逐步获得MPC-1和VLA-5(very late antigen-5)即CD49e。骨髓瘤细胞也与此相似［10］。Ishikawa等［11］提出，在淋巴滤泡生发中心被抗原激活的B细胞分化为前浆细胞，可出现于末梢血，形态为胞浆量少的淋巴样浆细胞，免疫表型为CD38+MPC-1-CD49e-，它们再返回骨髓逐步走向成熟。MM患者的瘤细胞为不同分化阶段混合的群体。Kawano等［12］在体外实验中发现，在骨髓瘤细胞的发育过程中，VLA-5-(very late antigen-5)即CD49e-的骨髓瘤细胞形态上不成熟，对于IL-6有增殖反应，而VLA-5＋的骨髓瘤细胞是成熟的细胞，对IL-6无增殖反应，但较VLA-5-的骨髓瘤细胞分泌更多的Ｍ蛋白。Suzanne 等［13］在研究成纤维细胞生长因子受体-3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）的抑制剂PD173074的过程中发现，小剂量PD173074可诱导骨髓瘤细胞系出现分化的形态学改变。采用ELISA方法检测细胞培养上清免疫球蛋白发现，轻链蛋白在随着分化的形态学改变的同时升高。
我们采用CD138+磁珠阳性分离法纯化了7例骨髓瘤患者原代骨髓瘤细胞，其形态表现为原始细胞，核浆比例大，有1-2个核仁，核染色质较疏松，有时可见核畸形，胞浆丰富，呈深蓝色，不透明。本研究中，较低剂量2-ME2处理36及72小时后，患者骨髓瘤细胞从形态学上可见向成熟发展，表现为核浆比例下降，核仁减少或消失，核染色质变致密，显示了2-ME2的促MM细胞分化作用。
【】
1Witzig TE，Timm M，Larson D，et al.Measurement of apoptosis and proliferation of bone marrow plasma cells in patients with plasma cell proliferative disorders.Br J Haematol，1999;104:131-137
2Hallek M，Bergsagel PL，Anderson KC.Multiple myeloma: increa-sing evidence for a multistep transformation process.Blood，1998; 91：3-21
3侯健，傅卫军主编.多发性骨髓瘤及其相关疾病.上海:上海技术出版社，2002：159-160
4张之南.血液病诊断及疗效标准.第2版.北京：科学出版社，1999:373-374
5Miltenyi S，Muller W，Weichel W，et al.High gradient magnetic cell separation with MACS.Cytometry，1990;11 :231-238
6Carey DJ.Syndecans: multifunctional cell-surface co-receptors.Biochem J，1997; 327 (Pt 1):1-16
7Klein B.Cytokines，cytokine receptors，transduction signals and onco-genes in human multiple1. Semin Hematol，1995; 32 :4-5
8Dhodapkar MV，Abe E，Theus A，et al. Syndecan-1 is a multifunctional regulator of myeloma pathobiology: control of tumor cell survival，growth，and bone cell differentiation.Blood，1998; 91: 2679-2688
9Greipp PR，Raymond NM，Kyle RA，et al.Multiple myeloma: significance of plasmablastic subtype in morphological classification.Blood，1985; 65:305-310
10Van-Riet I，Van-Camp B.The involvement of adhesion molecules in the biology of multiple myeloma.Leuk Lymphoma，1993; 9:441-452
11Ishikawa H，Kawano MM.Biological significance of heterogeneity in human myeloma cells.Int J Hematol，1998; 68:363-370
12Kawano MM，Huang N，Harada H，et al.Identification of immature and mature myeloma cells in the bone marrow of human myelomas.Blood，1993; 82:564-570
13Trudel S，Ely S，Farooki Y，et al.Inhibition of fibroblast growth factor receptor 3 induces differentiation and apoptosis in t(4;14) myeloma.Blood，2004; 103：3521-3528
