同种异体间充质干细胞复合纤维蛋白修复骨缺损
作者：窦强兵，孔荣，朱六龙，戴永立，沈勇
【关键词】 松质骨缺损
摘 要：
［目的］探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的体外培养，以及同种异体MSCs复合纤维蛋白修复兔股骨髁松质骨缺损的效果。［方法］在日本大耳兔双侧股骨髁制作06 cm×10 cm松质骨缺损，左侧植入同种异体MSCs纤维蛋白复合物，右侧单纯植入纤维蛋白。分别于术后2、5、8周行放射学、组织学检查，以了解骨缺损修复情况。［结果］单纯植入纤维蛋白的一侧不能自行愈合。植入复合物的一侧术后2周可见少量骨组织生成，5周可见大量模糊骨痂，术后8周骨缺损基本愈合。除少量炎性细胞浸润外，各期均未见明显免疫排斥反应。［结论］同种异体MSCs复合纤维蛋白可有效修复兔股骨髁松质骨缺损，8周内机体的免疫排斥反应较弱。
关键词：松质骨缺损； 间充质干细胞； 纤维蛋白； 同种异体
Abstract：［Objective］To discuss bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) culture in vitro and the curative effect of repairing cancellous bone defects in rabbits with the compound of allogenic MSCs and fibrin. ［Method］MSCs were isolated and cultureexpanted from rabbit bone marrow. Cancellous bone defects were created on bilateral femur condylar in 15 Japanese big ear rabbits, the left bone defects were treated with allogenic MSCs and fibrin, the right were treated with fibrin only. The bone defects were examined radiologically and histoloyically at the 2nd, 5th, 8th week after operation. ［Result］The defects with only fibrin implantation couldn't heal spontaneously and no bone formation were found at any timepoint. In the defects with compound of MSCs and fibrin implantation, there were a few bone formation within 2 weeks. By the 5th week plentiful callus were found, at the end of the 8th week, the defects healed. There was no immune respone except a few inflammatory cells infiltrate. ［Conclusion］The compound grafts of allogenic MSCs and fibrin shows low immunogenicity within 8 weeks and is an effective method for repairing cancellous bone defects.
Key words: Cancellous bone defect; Mesenchymal stem cells (MSCs); Fibrin; Allogenic
骨缺损常发生于创伤、感染、肿瘤切除等疾病，是骨科常见难题，在上近年兴起的以间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)为种子细胞的组织工程骨修复具有广阔的临床应用前景。本实验采用同种异体MSCs与纤维蛋白复合物修复兔股骨髁骨缺损，观察异体MSCs在体内的成骨及免疫情况，为临床使用同种异体MSCs提供实验依据。
1 材料和方法
11 MSCs的分离培养
4个月龄青紫蓝兔1只，重20 kg，用含肝素30 u／ml的注射器于股骨粗隆抽取骨髓2 ml， 加入含10％胎牛血清和青霉素及链霉素的DMEM培养基(Gibsco公司)中吹打混匀，置培养瓶中，37℃、5％C02、95％相对湿度的孵育箱内培养。5 d后半量换液，1周后全部换液，以后每周换液2次，逐步去除未贴壁细胞。14 d后贴壁细胞汇合到90％生长面积时，用025％的胰蛋白酶消化，按1∶2传代，取第2代MSCs备用。
12 MSCs纤维蛋白复合物的制备
取第2代细胞计数后制成50×106／ml的细胞悬液，按1∶1与纤维蛋白(医用安可胶)混合，置12孔培养板，37℃孵育箱内聚合1 h，收缩过夜后备用。
13 骨缺损模型的制作及处理
选用4～5个月龄日本大耳兔15只(安徽医科大学动物中心提供，清洁级)，重20～25 kg，雌雄不限。3％戊巴比妥30 mg／kg耳缘静脉麻醉，取膝关节外侧切口显露股骨髁，用手钻在股骨髁外侧宽大处制作06 cm×10 cm的松质骨缺损。将骨屑冲洗干净后，左侧植入同种异体MSCs纤维蛋白复合物，右侧单纯植入纤维蛋白。术后不固定肢体，分笼饲养，连续3 d使用青霉素预防感染。
14 术后观察
观察动物的进食、活动和切口愈合情况。分别于术后2、5、8周摄双膝关节侧位片，以了解骨缺损的修复。各期用空气栓塞法处死动物5只，大体观察缺损区修复情况，切取股骨髁骨标本，用10％中性福尔马林固定，脱钙切片后HE染色，光镜下观察新生骨痂和骨缺损愈合情况。
2 结 果
21 MSCs培养情况
培养的原代细胞混有大量红细胞，呈圆形、椭圆形或梭形，生长较慢。传代后细胞变纯，生长加快，呈集落样螺旋状生长，成纤维细胞形态。
22 实验动物情况
术后3～4 h麻醉清醒后基本可站立，前3 d活动、进食减少，以后逐渐恢复正常。切口无感染，其中1例取标本时发现关节腔感染。
23 放射学检查结果
植入同种异体MSCs纤维蛋白复合物的左侧，术后2周可见少量骨痂(图1)，5周可见大量模糊骨痂影(图2)，8周缺损区基本消失，为密度增高的骨痂影充填(图3)。单纯植入纤维蛋白的一侧(右侧)各期均未见明显骨痂，8周缺损区仍未得到修复，边缘呈增生、硬化表现。
图1 兔术后2周双膝关节侧位X线片，示左侧缺损区少量骨痂（略）
图2 兔术后5周双膝关节侧位X线片，示左侧缺损区大量模糊骨痂（略）
图3 兔术后8周双膝关节侧位X线片，示左侧缺损区基本消失，为密度增高的骨痂影充填，右侧仍未得到修复，边缘呈增生、硬化表现 （略）
图4 兔左侧股骨髁术后2周病理，示MSCs活跃，大量血管增生，反应性水肿(HE×40)（略）
图5 兔左侧股骨髁术后5周病理，示水肿减轻，有类骨质形成(HE×40) （略）
图6 兔左侧股骨髁术后8周病理，示软骨细胞、骨细胞增多，可见编织骨和板层骨，骨小梁明显(HE×40)（略）
24 组织学检查结果
植入同种异体MSCs纤维蛋白复合物的左侧，术后2周缺损区为纤维组织充填，MSCs活跃，大量血管增生，可见反应性水肿，有少量白细胞、淋巴细胞浸润(图4)；5周可见软骨细胞、骨细胞，有类骨质形成，水肿减轻(图5)；8周软骨细胞、骨细胞增多，可见编织骨和板层骨，骨小梁明显(图6)。单纯植入纤维蛋白的右侧各时间点均未见明显骨生长，缺损区为纤维组织充填，仅边缘有少量新生骨组织。
3 讨 论
MSCs是一种能分化为多种中胚层细胞的成体干细胞，实验表明MSCs具有体外成钙、体内成骨的能力。近年基于此的组织工程取得了诸多进展，主要表现在以自体骨髓MSCs为种子细胞复合不同载体修复各类骨缺损的实验研究和初步的临床应用。但自体MSCs的回植需经历抽取骨髓、培养扩增及质量控制检测等阶段［1］，并且自体骨髓MSCs的增殖、成骨分化能力随着年龄的增加而减弱［2］，不适合临床的实际应用。因此人们将研究转向同种异体 MSCs。Arinzen等［1］使用同种异体MSCs复合羟基磷灰石―磷酸三钙成功修复了狗股骨的节段性骨缺损，并指出其修复效果与自体MSCs相似，明显优于无细胞植入组。本实验也显示植入同种异体MSCs一侧2周左右即开始有少量骨组织生成，5周可见大量模糊骨痂影，8周基本完成修复；而单纯植入纤维蛋白的一侧8周仍无明显骨修复，骨缺损区为纤维组织充填。可以认为MSCs在同种异体内仍具有成骨能力。骨缺损的研究多采用皮质骨节段性骨缺损为模型，但也有作者指出兔股骨髁06 cm×12 cm的松质骨缺损不能自行愈合［3］。作者的实验也支持这种观点，兔股骨髁的松质骨缺损模型是可行的。
在机体对同种异体MSCs的免疫方面，目前较一致的看法认为MSCs是一种免疫特许细胞，不仅不引起机体的免疫排斥反应，而且还具有免疫抑制功能。有学者将MSCs与异体淋巴细胞进行体外共同培养，发现MSCs并不引起淋巴细胞的显著增殖，分化后的MSCs仍具有这种能力［4,5］。将同种异体MSCs单次输入狒狒体内，可使异体皮肤存活时间延长至14 d，与每天使用免疫抑制剂的效果相当［5］。Arinzen等［1］在实验中也指出植入同种异体MSCs的骨缺损组，在任何时间未检测到抗宿主反应；组织学上未发生淋巴细胞浸润，未检测到抗同种异体细胞抗体。也有作者认为同种异体MSCs的移植会引起机体的免疫反应，需要使用免疫抑制剂［6］。阳富春等［7］则指出向成骨方向分化的同种异体MSCs移植后，局部T淋巴细胞亚群的百分率呈先升高后下降的曲线，而外周血则总体表现为逐渐降低。本实验发现移植物局部有炎症反应，但并未完全影响MSCs的骨修复能力，表明同种异体MSCs植入后，宿主的免疫排斥反应较弱。因此，对同种异体MSCs的免疫方面还需进一步研究。
载体的选择也是骨组织工程的一个重要方面，单纯的细胞在体内容易流失，将MSCs与载体复合可克服这一缺点。纤维蛋白有利于MSCs的粘附与结合，可显著提高MSCs向成骨细胞方向的分化水平［8］。作为载体的纤维蛋白抗原性弱，生物相容性良好，在体内能完全分解，不影响机体对骨缺损的最终修复，而且还可根据需要制成相应的形状，可局部注射，具有广阔的临床应用前景。
总之，本实验表明同种异体MSCs复合纤维蛋白能成功修复兔股骨髁松质骨缺损，机体对同种异体MSCs的免疫排斥反应较弱。
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