川芎嗪洗脱支架预防支架内再狭窄的实验研究

【摘要】  目的：研究川芎嗪洗脱支架(TES)抑制内膜增生防治再狭窄的效果及其机制。方法:小型猪9只随机分为3组,实验组植入TES(TES组),对照组植入金属裸支架(BMS组)或雷帕霉素洗脱支架(SES组)。术后第28天处死动物，组织病检测内膜厚度，免疫组织化学法测定增殖细胞核抗原(PCNA)，TUNEL法测细胞凋亡，扫描电镜观察内皮细胞的覆盖情况。结果:术后第28天病理学证实，TES组较BMS组管腔面积增加、支架内新生内膜面积和面积再狭窄百分比减小（P<0.05）。BMS组较TES组PCNA 细胞阳性率明显增加（P<0.05），TES组较SES组PCNA阳性率增加（P<0.05）。TES组较BMS组单位面积内平滑肌细胞 (VSMC)凋亡数明显增加（P<0.05）。扫描电镜显示TES组和BMS组28 d血管内皮细胞完全覆盖，SES组基本覆盖，但内膜不平整。结论:TES可以显著抑制VSMC 增殖、迁移并促进VSMC凋亡,但不影响血管内皮愈合，是防治血管再狭窄的新策略。

【关键词】  川芎嗪； 药物洗脱支架； 再狭窄； 免疫组织化学

    经皮冠状动脉介入(PCI)是冠心病治疗的一个重要手段，但PCI术后再狭窄一直是影响PCI疗效的主要问题。单纯球囊扩张术由于早期血管弹性回缩及晚期内膜过度增殖、血管再重塑,使得术后再狭窄率高达30％～50％。冠状动脉内支架术能降低术后即刻残余狭窄并有效限制血管弹性回缩和动脉再塑型，使得PCI术后的再狭窄率明显下降。但由于支架植入术后依然存在内膜增殖，再狭窄发生率仍达20％～30％。药物洗脱支架(DES)通过抑制炎症反应和细胞增殖、延缓血管内皮化，使PCI术后的再狭窄率降至10％以内。但近期公布的随机试验结果认为,DES有增加远期非心性死亡和晚期血栓所致的心源性死亡和(或)心肌梗死的风险［1］。发掘新的抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和血管内膜的增生而不影响血管内皮愈合的洗脱药物,是研制新型DES和防治支架内再狭窄的新策略。本研究旨在研究川芎嗪洗脱支架(TES)抑制内膜增生、防治再狭窄的疗效和可能的机制。

    1  材料与方法

    1.1  动物的选择和预处理

    选用4～6月龄，体重为25～35 kg小型猪9只（均有检疫合格证明），雌雄不限。手术前1 d给予阿司匹林300 mg、氯吡格雷300 mg顿服。

    1.2  支架和涂层

    实验组(TES组)TES由金属裸支架(BMS)经喷涂川芎嗪单体(四甲基砒嗪，纯度为99%,购于上海华美制药厂)制成,含川芎嗪200 μg。对照组(SES组)雷帕霉素洗脱支架(SES)是由BMS经喷涂雷帕霉素（购自福建科瑞药业有限公司，纯度>98%）制成，含雷帕霉素130 μg。另一对照组(BMS组)采用相同结构BMS。实验组和对照组支架均为不锈钢316 L金属管形网状支架，两组支架大小为2.5～3.0 mm /16 mm。

    1.3  冠脉内支架植入

    猪术前予氯胺酮12 mg·kg-1肌肉注射基础麻醉，3％戊巴比妥钠20 mg·kg-1术前和术中间断静脉注射强化麻醉。备皮及皮肤消毒后穿刺股动脉,插入6 F动脉鞘注入肝素150～200 U·kg-1，常规行冠脉造影，为避免局部药物释放干扰,常规对同一头猪左前降支及左回旋支冠状动脉中段各植入相同类型的支架，支架球囊与血管直径比值为(1.1～1.2)∶1， 10～15 atm（1 atm=101.325 kPa）扩张30 s,形成冠状动脉狭窄模型［2］。术后每日喂阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg，并予以普通饮食喂养。

    1.4  病理学观察

    术后第28天行冠状动脉造影后处死动物，剥离冠状动脉，固定24 h后切片、染色。对内膜、中膜和外膜进行组织学分析，运用机图像分析系统测定血管狭窄程度。用免疫组织化学法测定增殖细胞核抗原(PCNA),TUNEL法测VSMC凋亡,扫描电镜下观察内皮细胞的覆盖情况。

    1.5  统计学处理

    3组数值均采用x-±s表示,两组间用独立样本t检验,使用SPSS 12.0统计软件进行分析,P<0.05为差异有显著意义。

    2  结    果

    2.1  小型猪支架植入情况

    9只猪均成功在左前降支及左回旋支冠状动脉中段植入支架, 支架植入术后即刻冠状动脉造影证实管腔通畅,无充盈缺损、管壁夹层、栓塞、支架移位或远端冠状动脉痉挛,无急性血栓形成。所有动物均顺利完成术后第28 天的复查。

    2.2  支架植入28 d后的冠状动脉内膜增殖情况

    见表1。

    TES组与BMS组相比, 支架内面积无显著差异,但管腔面积、新生内膜面积和平均面积狭窄百分比有显著性差异（P<0.05）。TES组与SES组相比支架内面积、 管腔面积、新生内膜面积和平均面积狭窄百分比均无显著差异。见图1。表1  支架植入28 d后冠状动脉内膜增生情况的比较

    2.3  PCNA阳性率及VSMC凋亡结果

    见表2。

    TES组内膜PCNA阳性率较BMS组明显降低（P<0.01）,TES组较SES组PCNA阳性率增加（P<0.05）。TES组较BMS组单位面积内VSMC凋亡数明显增加（P<0.01），TES组与SES组单位面积内VSMC凋亡数差异无显著意义。

    2.4  扫描电镜结果

    见图2。 表2  支架植入28 d后PCNA阳性率和单位面积VSMC凋亡数的比较TES和BMS组28 d血管内皮细胞完全覆盖，SES组基本覆盖，但内膜不平整。

    3  讨    论

    川芎嗪是从中药伞形科植物川芎(Ligusticum Chuanxiong) 的根茎中提取的有效成分,化学结构为四甲基吡嗪。已有临床试验证实,口服川芎嗪具有防治PCI术后再狭窄作用［3］。动物实验显示，TES与BMS相比，新生内膜面积明显减少,管腔面积明显增大，TES能抑制内膜增殖,无致栓性,具有良好的生物相容性［4］。本实验证实,与BMS相比，TES可显著抑制支架植入术后血管内膜增生和减少再狭窄的发生。TES预防支架内再狭窄的作用机理为:(1)抑制VSMC增殖、迁移。 内皮损伤后VSMC增殖并呈激活状态,细胞凋亡减少，PCNA、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、Bcl-2和c-myc的表达增高,Bax表达降低［5］。而川芎嗪通过抑制VSMC Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、FGF、PDGF和c-myc表达,达到抑制VSMC增殖的作用［6］。同时川芎嗪能通过降低细胞内钙调蛋白（CaM）、钙调神经磷酸酶（CaN）活性下调细胞内c-mya、PCNA表达水平，从而显著抑制血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的VSMCs增殖［7］。并且通过下调PDGF-BB刺激的骨桥蛋白mRNA的表达,削弱了VSMC的迁移能力［8］。本实验亦证实，内膜PCNA阳性率TES组较BMS组明显降低,提示TES可以抑制新生内膜VSMC的增殖,但较SES抑制新生内膜VSMC的增殖作用要弱。(2)促进VSMC调亡。川芎嗪通过抑制bcl-2 的表达、促进Bax 的表达, 从而促进VSMC的凋亡, TUNEL 染色阳性细胞数增多［6］。本实验证实,TES组较BMS组单位面积内VSMC凋亡数明显增加，提示TES能够诱导VSMC调亡。由此可见，抑制VSMC增殖、迁移并促进VSMC凋亡可能是TES预防支架内再狭窄的主要机制。

 

   第1代DES 导致支架内血栓的确切机制并未明确，目前考虑与手术操作本身、病人和病变的特性、支架的设计、过早的停用抗血小板药物等几个因素有关。虽然DES的最初目的是防止VSMC的增殖和迁移，但同时也导致了内皮化延迟或内皮功能异常，诱导了凝血激酶的表达，最终形成了前凝血激酶的环境［9］。TES相对于第1代DES具有其独特的优势：(1)血管内皮细胞的保护作用。川芎嗪作用于正常人胎儿脐静脉内皮细胞（HUVEC）后,通过上调一氧化氮合酶(NOS)、弹力蛋白、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶、谷光甘肽s-转移酶基因的表达，下调脂蛋白(a)、热休克蛋白60、细胞趋化因子和细胞色素P450系列等基因的表达,从而在基因水平通过多环节调节内皮功能［10］。并且通过增加前列环素(PGI2)释放, 减少内皮素（ET）基础释放量而对HUVECs具有促进增殖作用，并部分拮抗H2O2损伤HUVECs所致LDH、ET释放增加，PGI2释放减少和细胞内脂质过氧化产物丙二醛生成增加的作用。其机理可能与其抗脂质过氧化作用有关［11］。动物实验证实,川芎嗪可有效抑制结扎LAD后缺血再灌注对冠脉内皮细胞及心肌的损伤,减轻冠状动脉狭窄和心肌梗死的程度［12］。(2)抗血小板聚集和血栓形成。低浓度的川芎嗪通过抑制磷酸肌醇和TXA2的合成而发挥抗血小板作用;较高浓度的川芎嗪则通过结合血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物而抑制血小板的聚集［13］，并且通过增强NOS活性、刺激血小板中NO 的生成［14］以及发挥钙拮抗剂作用而使血小板内钙离子浓度降低,阻断钙离子对血小板激活和前列腺素的代谢［15］。以上实验结果均提示，川芎嗪在保护血管内皮,保持血管壁的平滑、完整,预防血栓的形成等方面具有重要价值。本实验进一步证实,BMS组28 d扫描电镜观察显示支架表面有完整的内膜组织覆盖，TES组28 d扫描电镜观察显示有完整的内膜组织覆盖，但有较多的白细胞浸润，考虑为多聚物引起的局部炎症反应。SES表面血管内皮基本覆盖，但有较多纤维素、白细胞等积聚。提示TES不影响血管内皮的愈合，而SES组血管内皮基本覆盖，但纤维素等的积聚可能增加支架内血栓形成的风险。

    由本实验可知,TES通过抑制VSMC增殖、迁移并促进VSMC凋亡的作用，降低了支架植入术后再狭窄的发生。同时由于其特有的血管内皮细胞的保护作用和抗血小板聚集和血栓形成的作用，不影响血管内皮的愈合，有降低支架内血栓形成风险的作用，是一种防治再狭窄的新策略。

【】
  ［1］PFISTERER M, BRUNNER-LA H P, BUSER P T, et al.Late clinical events after clopidogrel discontinuation may limit the benefit of drug-eluting stents:an observational study of drug-eluting vs.bare-metal stents［J］.J Am Coll Cardiol, 2006,48:2584-2591.

［2］袁晋青,高润霖,宋来凤，等.小型猪冠状动脉置入过大直径支架建立再狭窄动物模型［J］.循环杂志，1999,14(5):283-285.

［3］刘玉洁，孙根义，刘志勇，等.川芎嗪防治冠心病经皮冠状动脉介入术后再狭窄的临床研究［J］.中国心血管杂志，2004,9(2):90-92.

［4］陈立娟，马根山，陈忠，等.川芎嗪涂层支架生物相容性的实验研究［J］.医学，2006,34（6）：371-374.

［5］冯津萍，陈星，陈敏荔，等.血管内皮损伤后血管平滑肌细胞增殖的机制［J］.中华急诊医学杂志，2005,14（9）：727-730.

［6］冯津萍，卢奕， 陈星，等.川芎嗪对血管平滑肌细胞增殖抑制作用的探讨［J］.中草药，2007,38（1）：92-95.

［7］李映红，吴正治，郑红花，等.从CaN信号通路探讨川芎嗪对AngⅡ诱导的大鼠VSMCs增殖的抑制作用及机制［J］.上海中医药杂志，2006,40 （5）：46-49.

［8］张健，蔡生业，姚成芳，等.川芎嗪对PDGF-BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和骨桥蛋白mRNA表达的影响［J］.山东中医药大学学报，2005,29（3）：230-232.

［9］L?SCHER T F, STEFFEL J, EBERLI F R, et al.Drug-eluting stent and coronary thrombosis:biological mechanisms and clinical implications［J］.Circulation,2007,115:1051-1058.

［10］吴红金,吕俊萍,马增春,等.川芎嗪对培养人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2005,11（3）：40-43.

［11］林蓉，刘俊田，李旭，等.川芎嗪对血管内皮细胞损伤的保护作用［J］.中国药与毒理学杂志，2000,14 (6):425- 429.

［12］何维来，陈如坤，周汝元，等.川芎嗪对结扎犬LAD损伤冠脉内皮及心肌的保护作用［J］.第四军医大学学报，2005,26 (23)：2152-2155.

［13］ SHEU J R, KAN Y C, HUNG W C, et al.Mechanisms involved in the antiplatelet activity of tetramethylpyrazine in human platelets ［J］.Thrombosis Research,1997,88:259-270.

［14］ SHEU J R, KAN Y C, HUNG W C, et al.The antiplatelet activity of tetramethylpyrazine is mediated through activation of NO synthase［J］.Life Sci, 2000, 67:937-947.

［15］吴文元.川芎嗪周围动脉粥样硬化闭塞症疗效观察［J］.实用中医药杂志，2002,18 (8):5-6.