外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道局部甘露糖结合凝集素mRNA水平的测定

【摘要】  目的：初步探讨甘露糖结合凝集素（MBL）在外阴阴道念珠菌病（VVC）和复发性外阴阴道念珠菌病（RVVC）发病过程中的免疫机制。方法：选取2006年1月～2007年7月健康体检的女性、VVC患者、RVVC患者各20例，采集阴道灌洗液，半定量RT-PCR测定MBL-mRNA表达情况。结果：阴道局部MBL-mRNA的表达VVC患者显著高于正常人群，而RVVC患者显著低于正常人群。结论：VVC患者阴道局部MBL-mRNA高表达说明MBL参与了局部免疫反应，其在免疫防御中发挥了重要作用，而阴道局部MBL-mRNA的低表达可能和RVVC反复发作不易有关，提示有必要对MBL水平低下者进行MBL临床治疗的研究。

【关键词】  外阴阴道念珠菌病； 甘露糖结合凝集素； 阴道灌洗液； mRNA

    外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis,VVC）也称外阴阴道念珠菌病，是一种常见的阴道黏膜真菌感染性疾病， 75％的妇女一生中至少患1次VVC，临床上将每年发作VVC≥4次称为复发性外阴阴道念珠菌病（recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC）。对于VVC发病的免疫机制研究国内外报道甚少,且大部分研究只停留在动物实验阶段。本研究通过测定VVC患者阴道局部甘露糖结合凝集素（MBL）mRNA水平并与健康女性对照，探讨天然免疫在本病发病机制中的地位，以期为本病的免疫治疗提供理论依据。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象

    选取2006年1月～2007年7月在我院门诊健康体检女性，就诊的VVC、RVVC患者各20例，月经周期均，3组间各时相分布比较无显著差异。6个月内未服用甾体类激素，1周内无性生活及阴道冲洗。均排除妊娠、糖尿病和长期口服抗生素等易感因素。

    正常对照组：妇科门诊进行健康体检的女性。妇科检查无异常，阴道分泌物检查无异常。 VVC组：检查见典型豆渣样分泌物，镜检见真菌菌丝及孢子，无其它病原菌混合感染，符合VVC诊断标准［1］。RVVC组：妇科门诊检查符合RVVC诊断标准［1］，即VVC经抗真菌治疗后症状、体征消失，真菌学检查阴性，再次发生VVC者称为复发。真菌培养为白色念珠菌，无混合感染。

    1.2  标本的采集

    研究对象取妇科检查体位，暴露阴道后擦去分泌物，用5 ml灭菌生理盐水冲洗宫颈及阴道上端，吸出灌洗液4～5 ml收集于专用试管，1 000 r·min-1离心10 min，细胞成分置于EP管中-20 ℃冻存待测。

    1.3  半定量RT-PCR测定MBL-mRNA

    1.3.1  MBL基因特异性引物的设计与合成  根据GenBank MBL基因cds序列，引物由上海生物工程有限公司设计，上游引物为5′-AGGCATCAACGGCTTC CC-3′,下游引物为5′-CCAGGCTACTATCACCATCC-3′;另外设计1对片段长度为270 bp的β-actin基因引物,上游引物为5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′,下游引物为5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′。

    1.3.2  阴道灌洗液离心细胞成分总RNA的提取  按照Trizol说明书操作，提取的总RNA溶于去焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，测OD值，调RNA浓度为1 μg·μl-1，分装，然后-70 ℃冻存待用。

    1.3.3  RT-PCR反应体系  取1 μl RNA，55～60 ℃孵育10 min以消除RNA二级结构,在冰盒上依次加入10×RT-Buffer 2 μl、25 mmol·L-1 MgCl2  4 μl、10 mmol·L-1dNTP混合物 2 μl、Rnase抑制物 0.5 μl、去DEPC水 8.5 μl、Oligo dT 1 μl、AMV逆转录酶 1 μl,总反应体积 20 μl；42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min,5 ℃ 5 min;-20 ℃冻存。

    1.3.4  PCR反应  (1)25 μl PCR反应体系组成如下:5×RT-Buffer 5 μl、25 mmol·L-1 MgCl2  0.5 μl、上游引物(25 pmol·L-1) 1.0 μl、下游引物(25 pmol·L-1) 1.0 μl、Taq酶(5 U·μl-1) 0.25 μl、cDNA模板 5 μl、灭菌水 12.25 μl。(2)PCR扩增条件 :94 ℃ 2 min,94 ℃  30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30个循环,72 ℃ 7 min。然后1％琼脂糖电泳，Image Master VDS扫描仪观察电泳条带，拍照，Image Msater Total Lab软件分析图像。以β-actin作为内参分别MBL产物与β-actin产物OD积分的比值，观察MBL的表达水平。

    1.4  统计学分析

    所得数据采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。计量资料用x-±s表示，总体进行方差分析，组间比较用LSD法。

    2  结    果

    2.1  一般情况

    正常对照组20例，年龄(31.85±5.65)岁，卵泡期 11例，黄体期9例；VVC组20例，年龄(33.50±5.57)岁，卵泡期 8例，黄体期12例；RVVC组20例，年龄(33.35±5.65)岁，卵泡期7例，黄体期13例。3组平均年龄、年龄分布和月经周期的分布经χ2检验，均为P>0.05。

    2.2  阴道局部MBL mRNA表达水平的变化

    ODMBL/ODβ-actin之值正常组、VVC组和RVVC组分别为0.779±0.074、0.942±0.097和0.469±0.025,阴道局部MBL的表达VVC患者显著高于正常人群(P=0.008),而RVVC患者显著低于正常人群(P=0.000)。见图1、2。

    3  讨    论

    MBL为肝脏合成的C型凝集素，是重要的天然免疫分子，具有典型的可溶性胶原凝集素结构，其基本亚单位是由一个长形的胶原样区形成的尾部和一个球状区形成的头部组成，富含半胱氨酸的N末端连接区连接头尾两端，3个这样的亚单位连接成一个基本结构单位，这些三聚体2～6个聚合成寡聚物，形成相对分子质量高达500 000的郁金香花朵样四级结构［2］，此种结构易于与微生物表面的甘露糖结合。单一的三聚亚单位不能与固相甘露糖结合，因而不能结合补体，但通过寡聚化可明显增加MBL与配体结合的亲和力，在MBL相关性丝氨酸蛋白酶（MASP）的作用下启动补体的凝集素途径。

    VVC是妇科常见病、多发病，但其机制未明。近年来对该病免疫机制的研究呈现出渐增趋势，包括细胞免疫(CMI)、体液免疫以及天然免疫。CMI产生于机体感染念珠菌的早期，由Th1CD4+T细胞介导的CMI是抗念珠菌感染的主要宿主防御机制，Th1细胞产生的细胞因子可激活巨噬细胞和中性粒细胞进入抗真菌状态，Th2类细胞因子则通过抑制Th1细胞介导的噬菌作用增加对感染的易感性。但CMI的抗VVC作用受到质疑，多项研究证明尽管有正常水平的外周念珠菌特异性Th1型CMI，许多妇女仍然患有RVVC。Woznia等［3］研究发现，T细胞敲除或免疫缺陷的小鼠阴道念珠菌感染负荷与野生型小鼠相似，且阴道T细胞和炎性细胞因子均与局部念珠菌负荷无关。与CMI相似，体液免疫在念珠菌感染中的机制也受到质疑，有学者［4］定量检测念珠菌初次和再次感染鼠的阴道灌洗液和血浆中特异性IgA、IgG和IgM抗体，结果表明，抗念珠菌的特异性抗体并不总是在感染鼠的阴道分泌物中存在，因此，抗体介导的体液免疫保护作用是非常有限的。鉴于CMI和体液免疫的抗念珠菌机制受到质疑，作为抗念珠菌的第一道防线，天然免疫的地位日益受到重视。

    阴道局部的天然免疫一直是VVC免疫研究的热点。近年来的研究显示MBL是先天免疫系统的重要成分，有证据表明其至少通过4种途径发挥作用，即激活补体、促进调理吞噬、减轻炎症和促进凋亡［5-7］,在阴道中MBL可识别真菌的免疫因子并与之结合［7］。研究［8］证明，包括白色念珠菌在内的多种念珠菌显示了强大的与MBL结合的能力。Neth等［8］应用流式细胞术对患者体内分离的菌株进行体外研究发现，念珠菌和MBL有强大的结合力，结合于病原体后，MBL能与吞噬细胞凝集素受体结合启动吞噬过程,以凝集素途径激活补体，发挥免疫清除作用。Tabona等［9］通过转入MBL基因的小鼠注射白色念珠菌的实验证实，MBL参与了C3的活化。另外，巨噬细胞和树突状细胞可以识别MBL，并吞噬与MBL结合的微生物，从而达到免疫防御的作用。

    本研究发现，VVC患者阴道局部MBL的表达显著高于正常人群，可能是阴道局部对真菌产生的一种免疫防御反应，MBL与病原体表面的糖类结合再与吞噬细胞表面的受体相结合，直接发挥调理素的作用，并与凋亡细胞结合促进巨噬细胞对凋亡细胞的吸收，有利于巨噬细胞清除凋亡细胞。而在RVVC患者，阴道局部的MBL表达显著低于正常人群，多项研究表明，MBL血清浓度的降低会增加机体对感染性疾病的易感性，推测阴道局部MBL的低表达可能是VVC反复发作不易的原因之一。Babula等［10］测定阴道局部MBL的浓度在RVVC患者中明显低于健康人群，并发现这种浓度的减少可能和其编码基因的多态性有关，本研究结果与之基本一致。

    MBL的缺失能增加疾病的易感性。研究［11］表明，MBL基因敲除的小鼠无法有效地清除单纯疱疹病毒-2（HSV-2）；化疗后患者免疫系统受到损伤，其中MBL水平较低的个体很容易发生严重感染，且提高化疗后MBL水平会降低对病原体的敏感性［12］；Summerfield等［13］对儿童感染性疾病进行研究，MBL基因突变增加了机体患病的几率。因此，MBL的治疗理论上可增加机体对疾病的抵抗能力。已有学者［14］将MBL作为“疾病修饰药物”用作改善由MBL缺失引起的慢性疾病状况。理论上,MBL替代治疗可以包括输入天然血浆MBL和重组MBL等,有人应用亲和层析法纯化的血浆MBL治疗两位反复感染的病人，发现感染的频率明显降低。

    在阴道局部的天然免疫研究中尚有许多问题没有解决，局部MBL表达和基因多态性的关系，同血清MBL浓度是否一致，如何制备MBL产品等还需要深入研究。在今后的研究中，有必要进一步探讨MBL在VVC和RVVC的发病及机体免疫防御机制中的临床意义，以及MBL在女性生殖道的局部免疫中可能发挥的作用，为阴道炎的免疫治疗提供更可靠的理论依据。

【】
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