地高辛标记探针检测卫氏并殖吸虫的方法

【摘要】  目的 制备卫氏并殖吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(COⅠ)基因和核糖体DNA第二间隔区(ITS2)地高辛标记探针,探讨其对并殖吸虫的种别鉴定和诊断的作用。 方法 利用引物分别体外扩增获得卫氏并殖吸虫目的基因后凝胶电泳鉴定并且胶回收纯化上述两个基因片段。将酶切后的COⅠ基因和ITS2基因回收,地高辛标记成探针,尼龙膜上行斑点杂交观察。 结果 COⅠ探针有较好的特异性和敏感性。ITS2探针缺乏特异性。 结论 尼龙膜斑点杂交结果显示卫氏并殖吸虫的COⅠ基因片段可以作为种群鉴定的后备探针。

【关键词】  卫氏并殖吸虫; 地高辛; DNA探针; DNA,核糖体; 序列分析,DNA; 克隆,分子; 核酸杂交; 基因

    ABSTRACT:  Objective  To prepare digoxigenin-Paragonimus westermani COⅠ and ITS2 genes labeled probe and evaluate for species identification.  Methods  The genes were labeled with digoxigenin and used as probes.  DNA from the various parasites and rabbit control were applied to nylon transfer membranes, hybridized with labeled probes, and visualized according to the manufacturer’s instructions.  Result  The COⅠ probe hybridized well with DNA from Paragonimus westermani, but not with DNA from other species.  In contrast, ITS2 could hybridize with DNA from both Paragonimu westermani and other species.  Conclusion  The COⅠ gene of the Paragonimus westermani labeled with digoxgenin probes can be used for species identification.

    KEY WORDS:  Paragonimus westermani; digoxin; DNA probes; DNA,ribosomal; sequence/malysis,DNA; cloning,molecular; mucleic acid hybridization; genes

    并殖吸虫在全世界广泛分布,在亚洲、非洲、拉丁美洲30余国家及我国23个省市和自治区不同程度流行［1］。目前世界上报道的虫种将近50种,其中在我国报道和发现的并殖吸虫28种。对于并殖吸虫分类标准的认识不一,加之不同地区、不同宿主体内收集的虫体存在变异，标本处理和观察方法不同以及观察者的主观性等原因,造成虫种的鉴定和分类的复杂性。由于并殖吸虫致病类型多样,以及免疫学诊断与其他寄生虫之间存在较多交叉反应现象,目前尚无很好的诊断方法,误诊率达29.3％～57.6％［2］。本研究利用引物分别体外扩增获得卫氏并殖吸虫CO I基因和ITS2基因，用地高辛标记成DNA探针,利用探针和尼龙膜上已知的基因组反应来观测所获得的探针是否可以成为一种临床诊断和分类的后备探针,以进一步完善目前的诊断和分类方法。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  卫氏并殖吸虫成虫  从福建省闽清、建瓯、漳平等地采集溪蟹,分别放入研磨器中研磨捣碎,加水混匀通过40目筛过滤,过滤液置1 500 mL量杯中静置沉淀,去除上清液,镜检沉渣分离囊蚴、初步定种。将囊蚴放入生理盐水4 ℃冰箱短期保存。每只感染狗口服卫氏并殖吸虫囊蚴100个、三平正并殖吸虫囊蚴105个,每只感染大白鼠口服斯氏狸并殖吸虫囊蚴5个。3个月后检查粪便，阳性动物放血处死,相应部位检获成虫,生理盐水清洗,75％乙醇保存。

    1.1.2  主要试剂和仪器  PCR反应试剂盒(美国Promega公司);胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒(上海中科开瑞公司);尼龙膜(英国Amersham公司);地高辛标记试剂盒(上海Roche公司)。PCR扩增仪(PCR System 2400,美国PE公司);半自动凝胶图像分析仪(GDS-8000,美国Ultro-Violet公司);紫外分光光度计(Ultrospec 2100pro,英国Biochrom有限公司);低温冷冻离心机(2K15,德国Sigma公司)。

    1.2  方法

    1.2.1  引物设计与合成  引物由上海博亚生物公司合成。引物的序列如下:

    COⅠ基因

    上游引物:5’ GATTTTGCCTGGGTTTGGTA 3’

    下游引物:5’ ACGACGAACCACGTATCAT 3’

    ITS2基因

    上游引物:5’ ATATTGCGGCCACGGGTTA 3’

    下游引物:5’ TCACGTCTGATCCGAGGTC 3’

    1.2.2  PCR扩增  模板DNA 2.5 μL,上游引物(10 μmol/μL)1.0 μL,下游引物(10 μmol/μL)1.0 μL,10×PCR缓冲液2.5 μL,25 mmol/L MgCl2 2.5 μL,Taq酶(5 U/μL)0.2 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,灭菌双蒸水14.8 μL,按以下循环参数在PCR仪上进行反应:94 ℃预变性5 min→94 ℃ 1 min→57 ℃ 1 min→72 ℃ 2 min,35个循环,72 ℃ 5 min。

    1.2.3  PCR扩增产物的胶回收  按常规方法回收。

    1.2.4  探针制备  EcoRⅠ酶切后的卫氏并殖吸虫COⅠ基因和ITS2基因,在反应管中加模板DNA 0.09 μg,加入灭菌双蒸水至总量16 μL。在沸水中加热10 min,迅速放入冰浴中冷却,以使DNA完全变性。充分混匀随机引物(试剂1),并加4 μL到变性的模板DNA中,混匀,短暂离心,37 ℃水浴过夜。加入0.2 mol/L EDTA(pH 8.0) 2 μL终止反应。

    1.2.5  探针灵敏度测定  将标记好的探针和地高辛标记的对照DNA稀释成1 ng/μL,分别依次稀释至10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01 pg/μL,按浓度递增的顺序依次点样于尼龙膜上,点杂交法检测探针的灵敏度。

    1.2.6  斑点杂交  处理后尼龙膜置于0.4 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)中5 min。室温干燥,分别吸取卫氏并殖吸虫成虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、血吸虫成虫和兔基因组样品2 μL点样于膜上,室温下干燥,将载样膜于变性液饱和的滤纸变性5～10 min,转至中和液饱和的滤纸上中和30 min,平衡5 min,将载样膜于变性液饱和的滤纸上变性,室温干燥后120 ℃烘烤30 min,沸水中加热5 min,迅速放入冰浴中冷却,以使探针DNA完全变性。将制备好的杂交膜放入塑料袋中,加入预杂交液,68 ℃水浴30 min,去除预杂交液,迅速加入含变性探针的杂交液,42 ℃水浴过夜,杂交过夜。

 

   1.2.7  结果检测  取出杂交膜在2×SSC、0.1％SDS中室温漂洗5 min 2次,在0.5×SSC、0.1％SDS(预热到洗涤温度)中68 ℃漂洗15 min 2次,将膜用漂洗液脱色摇床上漂洗1～5 min,在阻断液100 mL中脱色摇床上摇动浸泡30 min。转入抗体液20 mL中浸泡30 min,漂洗液100 mL漂洗2次,每次15 min,在检测液20 mL中平衡2～5 min,在暗室中将膜浸泡在新鲜配制的显色液10 mL中,绝对避免摇动。16 h后用双蒸水或TE液50 mL冲洗5 min,终止显色反应,拍照保存。

    2  结  果

    2.1  PCR扩增产物的胶回收  PCR扩增卫氏并殖吸虫的成虫的ITS2和COⅠ基因的琼脂糖凝胶产物经胶回收试剂盒回收,产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳(图1)。

    M:marker; 1,2:COⅠ基因；4,5:ITS2基因.

    图1  卫氏并殖吸虫COⅠ基因和ITS2基因1.0％琼脂糖凝胶电泳

    Fig 1  1.0% agarose electrophoresis of CO I gene and ITS2 gene of Paragonimus westermani2.2  斑点杂交  卫氏并殖吸虫90 ng的COⅠ和ITS2基因部分序列经地高辛标记的探针分别和尼龙膜上卫氏并殖成虫基因组、斯氏并殖吸虫成虫基因组、三平正并殖吸虫成虫基因组、血吸虫成虫基因组和兔基因组杂交(上下两行的样品相同)。地高辛标记的卫氏并殖吸虫COⅠ基因片段可以和相应的卫氏并殖吸虫基因组反应,并且有比较好的特异性和敏感性;ITS2基因部分片段虽然能够和尼龙膜上的卫氏并殖吸虫基因组结合反应,但也能够和兔基因组结合反应,缺乏特异性(图2)。

    1:卫氏并殖吸虫; 2:斯氏并殖吸虫; 3:三平正并殖吸虫; 4:日本血吸虫; 5:兔基因组; 6空白对照组

    图2  各基因组斑点杂交结果

    Fig 2  The result of the blot hybridization

    3  讨  论

    由于肺吸虫寄生部位多变,发育程度各异,仅凭病原学诊断颇为困难,即使是肺型的肺吸虫病也甚难检测到虫卵［2］。我国肺吸虫病的首诊误诊率很高,多误诊为肺结核、肺炎、肺肿瘤甚至肝癌等［3-7］。国内外有许多利用穿刺获得病变组织进而提取病变组织基因组行临床诊断的报道［8］,临床已经利用细针穿刺吸取组织进行检查并殖吸虫病［9］,但是由于肺吸虫体积较大,不能完整取样,遇到取出的样本中含有破裂不全的虫体或者虫体严重变形时,常规方法无法鉴定。

    地高辛是目前最常用的非放射性的半抗原性标记物。该法标记的探针稳定性好,可以在低温下长期保存［10］。核酸分子杂交技术以其灵敏度高,特异性高和简单易行等特点被广泛用于基因组中特定基因序列的定量和定性检测、基因突变的分析、基因克隆的筛选、微生物的检测［11］。本研究利用胶回收目的基因片段,紫外分光光度计检测浓度,分别取的DNA模板90 ng制备探针,检测探针标记效果,将饱和酚提取的卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、血吸虫和兔基因组分别取2.0 μL点样于尼龙膜上行核酸杂交反应。

    本研究显示地高辛标记的卫氏并殖吸虫COⅠ基因片段可以和相应的卫氏并殖吸虫基因组反应,并有较好的特异性和敏感性,能够在纳克级水平检测出卫氏并殖吸虫基因组。地高辛标记的卫氏并殖吸虫ITS2基因部分片段能够在纳克级水平和尼龙膜上的卫氏并殖吸虫基因组结合反应,也能够和兔基因组结合反应,缺乏特异性。本研究表明地高辛标记探针检测卫氏并殖吸虫的方法有一定的临床实用价值,今后可以在特异性、灵敏度、准确度、和最小检出量进行深入研究。

 

【】
  ［1］ 许隆祺,余海森,徐淑惠. 人体寄生虫分布与危害［M］. 北京:人民卫生出版社, 2000:164-165.

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