平颤颗粒治疗帕金森病的药效学研究
【摘要】 目的: 观察平颤颗粒对帕金森病（PD）模型鼠的行为及多巴胺能神经元的影响并探讨其PD的作用机制. 方法: 运用6?羟基多巴胺两点注射法损毁大鼠右侧黑质致密部(SNC)和腹侧被盖区(VTA)多巴胺能神经元，制备PD模型，将模型成功大鼠随机分为模型组、美多芭组、平颤颗粒低、中、高剂量3组以及联合用药组，另设正常对照组, 每组10只，分别给予相应处理，连续5 wk观察各组大鼠处理前及处理后3，4，5 wk行为学的变化，通过脑黑质酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化染色观察多巴胺（DA）能神经元的损伤程度，并采用高效液相色谱法观察脑黑质DA及3,4?二羟基苯乙酸(DOPAC)含量变化. 结果: 平颤颗粒高、中剂量组大鼠的旋转次数多于美多芭组及联合用药组（P<0.05），但均少于模型组（P<0.05或P<0.01），模型组大鼠与治疗前比较旋转次数有显著增加（P<0.05），正常组大鼠行为则无变化；免疫组化检测显示平颤颗粒高、中剂量组黑质TH阳性神经元数目高于模型组，但低于正常组（P<0.05）；高效液相色谱?电化学检测结果表明，各组大鼠中脑DA及DOPAC含量均低于正常组，平颤颗粒高、中剂量组低于联合用药组及美多芭组（P<0.05），而平颤颗粒低剂量组与模型组比较差异无显著性. 结论: 平颤颗粒能部分改善PD大鼠旋转行为，并减轻黑质细胞的受损程度，提高下降的DA水平，从而对PD起到治疗作用.
【关键词】 帕金森病；平颤颗粒；旋转行为；酪氨酸单氧化酶；多巴胺
【Abstract】 AIM: To observe the effects of Pingchan Potion on the rotation action and the dopaminergic neuron in Parkinson disease(PD) model rats and explore the pharmacodynamics of Pingchan Potion. METHODS: PD model rats were established by microinjection of 6?hydroxydopamine solution into right ventral tegmental area (VTA) and substantia nigra pars compacta(SNC) of the mesencephslon. The 60 PD rats were divided randomly into six groups: model group, madopar group, Pingchan Potion (16,8,4 g/kg) group and combined group. In addition, ten rats were included in the normal control group. All rats were continually treated for 5 weeks. The rotational behavior of rats before and after treatment by apomorphine was observed. After 5 weeks, the number of tyrosine hydroxylase (TH) positive cells were detected by immunohistochemical method, and dopamine（DA）and its metabolic products in nigrostriatal system of each group were determined by using high?performance liquid chromatography coupled to electrochemical detection (HPLC?ECD). RESULTS: Compared with model group, the times of rats rotation were decreased respectively after 3?week treatment in the madopar group and combined group（P<0.05）; the times of rats rotation didn?t decrease in Pingchan Potion 16 g/kg and 8 g/kg group, but it did not change obviously in 4 g/kg group(P>0.05); the times of rats rotation in model group increased post?treatmeat (P<0.05), and the behaviour of normal group didn?t change. The number of TH positive cells in substantial nigra of rats treated with Pingchan Potion 16 g/kg and 8 g/kg was higher than that of model group(P<0.05), yet lower than that of normal group. The levels of DA and 3,4?dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) in the rats of Pingchan Potion (16,8 g/kg) and madopar and combined groups were higher than that of the model group (P<0.05), but lower than that of normal group, the levels of DA and DOPAC in Pingchan Potion 4 g/kg group did not significantly change. CONCLUSION: Pingchan Potion could partially improve the rotational behavior in PD model rats, and provide a protective effect against 6?OHDA ?induced neuronal death in parkinsonian model by reducing DA neuron loss and increasing DA content.
【Keywords】 Parkinson disease； pingchan Potion； rotational behavior； tyrosine 3?monooxygenase； dopamine
0 引言
帕金森病（Parkinson′s disease, PD）是中老年人常见的神经系统变性疾病，其主要病理改变是中脑腹侧、特别是黑质致密部多巴胺（DA）能神经元进行性变性缺失, 导致神经递质DA匮乏. 由于PD 的发病机制尚不清楚，临床治疗仍以多巴制剂替代为主，但其长期应用会出现明显的副作用或不同程度的药效减退,并可加速PD的病程［1］. 平颤颗粒为纯中药制剂,以往临床研究表明其能有效地改善PD患者的运动症状和精神症状［2］,且未发现明显的毒副作用. 我们采用6?羟基多巴胺（6?OHDA）制备PD大鼠模型，观察平颤颗粒对PD模型鼠的行为及黑质DA能神经元的影响，探讨其治疗PD的疗效机制，从而为临床应用提供用药依据.
1 材料和方法
1.1 材料 清洁级SD大鼠(第四军医大学实验动物中心)88只,雄性,体质量180～220 g，2～3 mo龄；6－羟基多巴胺（6?OHDA）,多巴胺(DA)标准品,阿朴吗啡（APO）,小鼠抗酪氨酸羟化酶抗体(TH)均购自sigma公司；3,4?二羟基卞胺（DHBA）,3,4?二羟基苯乙酸（DOPAC）购自sigma?aldrich公司；兔抗小鼠IgG，ABC试剂盒，DAB显色剂（北京中杉公司）；美多芭片（上海罗氏制药有限公司，批号：SH0436）；平颤颗粒（第四军医大学西京药剂科，批号: 060904，方含何首乌、白芍、枸杞子、肉苁蓉、川芎等中药，其中每克干粉含生药量6.36 g. 实验时用蒸馏水溶解）；脑立体定位仪(日本Tokyo Narishige公司)；SM900冰冻切片机（美国Leica公司）；LC?10A高效液相色谱仪；L?ECD?6A电化学检测器(日本岛津公司)；C?18色谱分析柱（46 mm×250 mm，5 mm，安捷伦公司）；5810R型高速低温离心机（美国Eppendorf公司）.
1.2 方法
1.2.1 模型建立 参照［3］的方法，用1 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉. 按大鼠脑立体定位图谱(GeorgePaxinos ＆ Charles Walson,2005)定位. 确定右侧中脑两坐标：黑质致密部（SNC）：前囟后（5.2±0.1） mm，矢状缝右侧（2.0±0.1） mm，颅骨下(8.2±0.1) mm；中脑腹侧被盖区（VTA）定位坐标为：VTA: 前囟后(4.8±0.1) mm，矢状缝右侧(1.0±0.1) mm, 颅骨下(8.0±0.1) mm.用10 μL微量注射器抽取新鲜配制的6?OHDA液5 μL（共10 μg，溶于含1 g/L抗坏血酸的生理盐水中），以1 mL/min缓慢推药，留针5 min，以1 mm/min缓慢退针. 腹腔注射青霉素，连续7 d. 术后1 wk开始行为检测, 按0.5 mg/kg腹腔注射阿朴吗啡,观察其行为变化, 连续测试2 wk,若大鼠恒定转向左侧且旋转圈数＞6圈/min(240圈/40min) 则视为造模成功,同时注意观察是否伴有震颤、活动迟缓、抓握、嗅探等异常行为.
1.2.2 动物分组及处理 将造模成功的大鼠随机分为模型组、美多芭组、平颤颗粒高(16 g/kg）,中(8 g/kg),低(4 g/kg)剂量组以及联合用药组（美多芭用量为美多芭组量的1/4，平颤颗粒为8 g/kg），以正常大鼠为阴性对照组，每组各10只，共7组. 于每日09∶00～10∶00对正常对照组和模型组大鼠用蒸馏水2 mL灌胃，美多芭组用美多芭混悬液2 mL（含美多芭125 mg/kg，相当于临床等效剂量40倍）灌胃，连续5 wk.
1.2.3 行为学检测 分别于大鼠经灌胃处理后3，4，5 wk进行实验，腹腔注射阿朴吗啡0.5 mg/kg诱发旋转，实验过程同造模后的旋转实验鉴定，记录给药后40 min的旋转次数.
1.2.4 免疫组化(IH)法检测TH阳性细胞数 行为学检测完毕后将大鼠麻醉、开胸，动脉插管，以9 g/L生理盐水冲洗血液，随后灌注含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L PB液, 4℃, 完整剥取脑组织,后固定,蔗糖内梯度脱水,取前囟后4.2～5.5 mm范围作连续冰冻冠状切片，片厚40 μm，将切片入0.01 mol/L PBS（pH7.4）漂洗后，30 mL/L H2O2溶液（0.01 mol/L PBS稀释）处理10 min，漂洗3次，山羊血清封闭，加小鼠抗TH mAb(1∶800),4℃孵育48 h,漂洗3次，入生物素化兔抗小鼠IgG(1∶200)室温孵育24 h，漂洗3次，入ABC复合物(1∶100)室温孵育2～3 h，漂洗3 次,DAB液显色，贴片，室温下过夜. 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片. 每只大鼠选取5张切片，分别累计右侧黑质区TH免疫反应阳性神经元数目，进行统计学分析.
1.2.5 高效液相色谱法(HPLC)测定PD鼠脑黑质DA及DOPAC的变化 在行为学检测后，每组各取5只大鼠麻醉，迅速断头、取脑，在冰盘上分离出右侧中脑吸干表面水份后称质量并记录，-80℃保存. 检测时各组准确称取80 mg，分别加入0.1 mol/L高氯酸缓冲液490 μL（内含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA?Na2））以及内标溶液10 μL（DHBA 0.02 g/L）,在冰浴中匀浆，高速离心30 min（15 000 g，4℃）,上清液于15 000g再次低温离心10 min,取上清液10 μL进样检测. 流动相：40 mmol/L乙酸钠?30 mmol/L柠檬酸缓冲液，内含0.2 mmol/L EDTA?Na2，0.4 mmol/L辛烷基磺酸钠（B8）以及180 mL/L甲醇，调pH 4.1，经真空抽滤超声脱气15 min后使用. 流动相流速为0.5 mL/min,参比电极Ag/AgCl，电化学检测器电压为＋0.8 V.
统计学分析： 所有实验数据均以x±s表示，应用SPSS11.0统计软件进行单因素ANOVA检验，P<0.05为有统计学意义.
2 结果
2.1 平颤颗粒对前后大鼠旋转行为的影响 美多芭组大鼠给药2 d后死亡1只，其余各组均无死亡. 正常对照组于治疗前后行为均无显著变化；与治疗前比较，模型组大鼠旋转圈数不断增加， 3 wk后差异有统计学意义（P<0.05，表1），反应迟钝、震颤、嗅探等异常行为无减少；美多芭组与联合用药组于第3 wk旋转次数即明显减少，至第5 wk旋转次数减少显著，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01)，其它异常行为明显减少；平颤颗粒高、中剂量组于给药4 wk后与模型组比较旋转圈数减少（P<0.05），低剂量组给药后第5 wk旋转次数有所减少，但与治疗前比较无显著差异.
表1 各组大鼠治疗前后40 min旋转次数的变化（略）
aP<0.05, bP<0.01 vs治疗前； cP<0.05, dP<0.01 vs模型.
2.2 平颤颗粒对TH表达的影响 正常对照组可见密集的棕黄色TH阳性细胞表达，模型组则见少量、稀疏的TH阳性细胞；给予高、中剂量的平颤颗粒治疗后，脑黑质TH阳性神经元数目较模型组明显升高，分别为（54.1±3.7）和（51.0±3.0），与模型组（17.6±3.4）相比，差异有统计学意义（P<0.05，图1)；低剂量组阳性细胞数（22.0±1.2）表达与模型组比较有所增多，但差异无统计学意义.
A: 正常对照组; B: 模型组; C: 平颤颗粒低剂量组; D: 平颤颗粒中剂量组; E: 平颤颗粒高剂量组.
图1 术侧SNc区不同
处理组TH阳性细胞图 DAB染色×100（略）
表2 各组术侧脑黑质多巴胺（DA）及3,4?二羟基苯乙酸（DAOPAC）水平的变化（略）
aP<0.05, bP<0.01 vs美多芭; cP<0.05，dP<0.01 vs模型.
2.3 平颤颗粒对大鼠脑黑质DA和DOPAC的影响 各组DA及DOPAC水平均低于正常对照组(P<0.05或P<0.01，表2）,平颤颗粒高、中剂量组水平高于模型组（P<0.05），但低于联合用药组、美多芭组（P<0.05）,联合用药组与美多芭组比较无显著性差异（P>0.05），平颤颗粒高、中剂量组之间差异无统计学意义.
3 讨论
研究认为，PD基本病理改变为中脑黑质－纹状体DA能神经元变性和丢失，导致DA含量减少. 6－OHDA是一种神经毒素，可能通过氧化应激、细胞内钙超载等作用机制损毁儿茶酚胺类神经元，因此能够模拟人类PD症状和病理的特征性变化.我们采用6?OHDA单侧脑内两点注射法制作PD大鼠模型，运用阿朴吗啡诱发PD大鼠偏侧旋转行为，以旋转次数>6圈/min为成功模型. 结果发现随着平颤颗粒给药剂量及时间的增加，大鼠旋转行为明显降低；平颤颗粒联合美多芭（用量为美多芭组的1/4）给药与单一美多芭给药大鼠的旋转行为无显著差别，表明联合用药组中平颤颗粒对美多芭具有“增效”的作用. 免疫组化染色结果显示平颤颗粒高、中剂量组的TH阳性细胞数均显著大于模型组，提示应用平颤颗粒可能会减少PD大鼠黑质神经元的损伤和丢失. HPLC法检测术侧中脑黑质部DA及DOPAC的水平，发现平颤颗粒高、中剂量及联合用药组DA及DOPAC水平明显高于模型组，与免疫组化检测结果及行为学结果相一致，且联合用药能够减少西药用量，达到其“增效减毒”的效果.
PD在中医属“颤证”范畴，肝肾虚损是其最根本的病理基础，治疗上大多以培补肝肾为主. 大量实验证据表明，在黑质神经元的变性过程中，自由基代谢紊乱是其发生机制的关键环节. 现代药理研究表明，单味中药何首乌、肉苁蓉、白芍、枸杞子、川芎均具有明显的抗氧化作用［4-8］；何首乌还通过抑制脑内B型单胺氧化酶（MAO?B）活性、调节细胞凋亡、拮抗钙离子等发挥神经保护作用［9］；天麻可提高纹状体DA含量，对神经递质平衡有一定调节作用；川芎的主要成分川芎嗪通过提高脑组织中Ca?ATP酶活性发挥钙拮抗作用；白芍尚具有抗胆碱作用［10］. 该制剂可能通过清除自由基、钙拮抗、调节DA等神经递质达到治疗PD的目的.
【】
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