缺血后处理及川芎嗪对大鼠肾缺血再灌注氧自由基的影响

【摘要】  目的： 探讨缺血后处理及川芎嗪对大鼠肾缺血再灌注氧自由基的影响. 方法： 成年雌性SD大鼠32只，随机分为4组，每组8只，分别为： 假手术对照组（S组）、缺血再灌注组（I/R组）、川芎嗪组（I/R+T组）和缺血后处理组（IPO组）. 各组动物于再灌注24 h时取血，检测血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr），同时留取肾组织进行匀浆，测定匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量和总抗氧化能力（TAC）. 结果： 与I/R组大鼠相比，I/R+T组和IPO组大鼠的BUN和Cr均下降（P<0.01），SOD升高（P<0.01），MDA下降（P<0.01），CAT升高（P<0.05），TAC升高（P<0.01）；与I/R+T组大鼠相比，IPO组大鼠的BUN，Cr，SOD，MDA，CAT和TAC均无统计学差异（P>0.05）. 结论： 缺血后处理能够抑制肾脏缺血再灌注损伤后氧自由基的过度生成，对缺血再灌注损伤有一定的保护作用，其保护效应与川芎嗪治疗无明显差异.

【关键词】  缺血后处理；肾；再灌注损伤；川芎嗪；氧化损伤

　　【Abstract】 AIM： To investigate the effects of ischemic postconditioning and Ligustrazine on oxygen free radicals in renal ischemia reperfusion rat models. METHODS： Thirty?two female SD rats were randomly divided into 4 groups (n=8 in each group): sham?operation group(S group), ischemia reperfusion group (I/R group), Ligustrazine treatment group(I/R+T group), ischemic postconditioning group(IPO group). The blood samples were draw from the inferior vena and the nephridial tissues were homogenated after 24 h reperfusion. The serum urea nitrogen（BUN）and creatinine (Cr) levels were measured. The renal superoxide dismutase (SOD) activities, catalase（CAT）activities, malondialdehyde（MDA）contents and total anti?oxidant capacity (TAC) were detected. RESULTS： Compared with I/R group, BUN, Cr levels and MDA content were significantly lower（P<0.01）, the SOD activites（P<0.01）,CAT activites （P<0.05）and TAC （P<0.01） were significantly higher in I/R+T group and IPO group. There was no significant difference in BUN, Cr, SOD, MDA, CAT and TAC between I/R+T group and IPO group（P>0.05）. CONCLUSION： Ischemic postconditioning may protect the kidney from ischemia reperfusion injury in rats by depressing the production of free radicals, and there is no significant difference in protective effect between I/R+T group and IPO group.

　　【Keywords】 Ischemic postconditioning； kidney； reperfusion injury； ligustrazine； oxidative damage

　　0  引言
   
　　缺血后处理（Ischemic Postconditioning，IPO）可对心、脑、肝和肾［1- 3］等器官的再灌注损伤产生保护作用，然而其机制尚不十分清楚. 肾脏缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury，IRI）是一种常见的临床病理生理过程，氧自由基的参与是其损伤的重要因素之一. 川芎嗪（Ligustrazine）作为植物川芎根茎中的主要成分之一，具有很强的抗氧化作用，其对肾脏IRI的保护作用已被实验证实［4］. 我们在建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型的基础上，通过检测缺血后处理及川芎嗪治疗后大鼠肾组织氧化和抗氧化损伤等指标的变化，探讨其对大鼠肾脏缺血再灌注氧自由基的影响.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  健康成年雌性SD大鼠32只，体质量（232.5±10.2） g（第四军医大学实验动物中心提供），动物许可证号SCXK（军2002?005）；Cobas Integra 400 Plus全自动生化分析仪；SOD试剂盒、MDA试剂盒、CAT试剂盒和TAC试剂盒（南京建成生物工程研究所）；川芎嗪注射液（无锡市第七制药有限公司，批号06062013）；UV?754分光光度计（上海第三分析仪器厂）.

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物分组与模型制作  将动物随机分为4组，每组8只. 即假手术组（S组）、缺血再灌注组（I/R组）、川芎嗪治疗组（I/R+T组）和缺血后处理组（IPO组）. 所有动物实验前12 h禁食，自由饮水，以30 g/L戊巴比妥钠溶液按照50 mg/kg的剂量行腹腔注射麻醉. S组：沿腹正中线逐层切开各层组织，暴露双侧肾脏，游离右侧肾蒂并将其结扎，暴露伤口45 min后将各层组织逐层缝合，24 h后留取标本. I/R组：开腹后游离双侧肾脏，分离出双侧肾动脉，结扎右侧肾蒂，左侧肾动脉用无损伤动脉夹钳夹，45 min后松开动脉夹恢复血供. I/R+T组：在左肾缺血45 min后进行再灌注至30 min时，于腹腔内注射川芎嗪注射液32 mg/kg进行治疗，而后每6 h注射1次，共4次. IPO组：在阻断左肾动脉血流45 min后，给予反复10次的恢复血流20 s,阻断血流20 s的处理，然后再完全恢复血流供应.

　　1.2.2  标本留取  术后将大鼠置于笼内自由饮食，在再灌注24 h时将大鼠按照血液、肾组织的顺序留取标本. 将大鼠麻醉后固定于操作台上，打开腹腔后从下腔静脉抽取静脉血2～4 mL置于抗凝管内，静置4 h后以4500 r/min离心15 min分离血清，-70℃保存待用.分离左侧肾脏周围结缔组织后，以4℃冰生理盐水冲洗表面血液，滤纸吸干表面水份，将肾脏纵剖后取肾皮质约100～200 mg，精确称重后用剪刀剪碎移入匀浆管内按W/V=1/9的比例加入4℃生理盐水，在冰浴中进行匀浆，制备成100 mg/L的肾组织匀浆液，以4℃低温离心机3000 r/min离心15 min，取上清液于液氮速冻后置于-70℃冰箱中保存待用.

　　1.2.3  检测指标  各组标本采集完成后均于1 wk内完成各项指标检测.① 肾功能指标：用生化分析仪测定各组大鼠血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）；② 肾组织氧化损伤和抗氧化指标: 超氧化物歧化酶（SOD）采用黄嘌呤氧化酶法；丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸(TBA)法；过氧化氢酶（CAT）采用可见光分光光度计法；总抗氧化能力（TAC）采用化学比色法.均严格按照试剂盒说明进行操作.
   
　　统计学处理： 实验数据以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD?t检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2  结果

　　2.1  血清BUN和Cr含量的变化  与S组比较，I/R组血BUN和Cr水平升高（P<0.01）；与I/R组比较，I/R+T组和IPO组血BUN和Cr水平下降（P<0.01）；与I/R+T组比较，IPO组血BUN和Cr水平下降，但无统计学意义（P>0.05，表1）.

　　表1  各组血清中Cr和BUN的变化（略）

　　aP<0.01 vs S组； bP<0.01 vs I/R组. S： 假手术组；I/R： 缺血再灌注组； I/R+T： 川芎嗪治疗组； IPO： 缺血后处理组； BUN： 尿素氮； Cr： 肌酐.

　　2.2  肾组织SOD，MDA，CAT和TAC的变化  与S组比较，I/R组SOD，CAT和TAC水平均有下降（P<0.01），MDA水平升高（P<0.01）；与I/R组比较，I/R+T组和IPO组SOD水平升高（P<0.01），MDA水平下降（P<0.01），CAT水平升高（P<0.05），TAC水平升高（P<0.01）；与I/R+T组比较，IPO组SOD水平有下降，但无统计学意义（P>0.05）, MDA，CAT和TAC水平有升高，但无统计学意义（P>0.05，表2）.

　　表2  肾组织中SOD，MDA，CAT和TAC的变化（略）

　　aP<0.01 vs S组； bP<0.01, cP<0.05 vs I/R组. S： 假手术组； I/R： 缺血再灌注组； I/R+T： 川芎嗪治疗组； IPO： 缺血后处理组； SOD： 超氧化物歧化酶； MDA： 丙二醛； CAT： 过氧化氢酶； TAC： 总抗氧化能力.

　

　3  讨论 
   
　　在肾脏发生缺血再灌注损伤时，有多种因素参与了这一过程［5］，其中爆发式产生的氧自由基是引起细胞生物分子结构变化和细胞功能损伤的重要原因. 既往研究证实［6］，氧自由基在肾缺血再灌注损伤中起了非常重要的作用,是肾脏再灌注损伤的重要介质. 根据我们建立的肾脏缺血后处理动物模型［7］，采用缺血45 min后进行反复10次的恢复血供20 s,阻断血供20 s的处理，可有效减轻肾脏缺血再灌注损伤，因此我们在此模型的基础上对氧自由基的变化进行了研究.
   
　　本研究所采用的观察指标是目前公认的能较好反映组织内氧自由基水平及氧化损伤程度的间接指标［8］. 其中SOD能催化超氧自由基O2?转变为H2O2和O2的歧化反应，从而清除体内过剩的氧自由基，其活力的高低间接反应了机体清除自由基的能力. MDA是脂质过氧化物的终末产物，检测其含量可反映机体内脂质过氧化的程度，并间接反映组织细胞受自由基攻击的严重程度. CAT是抗氧化应激酶系的重要成员之一，能有效地清除生物体内的自由基. TAC代表组织中总的抗氧化能力，可很好地反映机体防御系统抗氧化能力的强弱. 以上指标可准确反应出组织氧化损伤和抗氧化损伤的水平.
   
　　已有研究证实缺血后处理所产生的心肌细胞保护作用与氧自由基产生减少有关［1］，国内学者在缺血后处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的研究中，有关氧自由基的变化的也有着同样的趋势［3］. 我们的研究发现，与S组相比I/R组SOD,CAT和TAC水平均有下降，MDA含量升高，这表明缺血再灌注时机体组织内抗氧化酶活性下降，脂质过氧化损伤加重，I/R组血BUN和Cr的升高表明此时肾功能相应下降.与I/R组相比，IPO组大鼠肾组织中SOD,CAT和TAC升高，MDA含量下降，这一结果表明缺血后处理能提高机体组织内抗氧化酶的活性，使再灌注后过度产生的氧自由基被及时清除，同时 MDA含量下降表明经缺血后处理后肾组织内脂质过氧化损伤程度减轻. 同时肾功能检测结果显示，IPO组的血BUN和Cr较I/R组下降，这与SOD活性的升高和MDA含量下降的结果相一致，表明随着肾组织内过多氧自由基的被清除、氧化损伤的减轻，肾功能相应的得到改善.
   
　　川芎嗪为植物川芎根茎的主要成分之一，具有抗氧化、改善微循环、抑制血小板凝集等作用，研究表明川芎嗪可对肾脏缺血再灌注损伤起到保护［4,9］. 在我们的研究中观察到川芎嗪组较再灌注组肾组织中SOD,CAT活性和TAC升高，MDA下降，表明经川芎嗪治疗后肾组织内的抗氧化酶水平和总抗氧化能力明显增高，脂质过氧化的程度减轻，这一结果同既往的川芎嗪在肾缺血再灌注损伤中的研究结果基本一致［10-11］. 与缺血再灌注组比较，缺血后处理组和川芎嗪治疗组的SOD,CAT和TAC均增加，MDA下降，且两组间各指标无统计学差异，表明缺血后处理和川芎嗪在对缺血再灌注损伤的保护机制中可能存在着共同的途径，即通过抑制缺血再灌注后氧自由基的过度生成，减少氧自由基对组织的氧化损伤而发挥保护作用.
   
　　综上所述，缺血后处理可提高缺血再灌注后肾组织中抗氧化酶的活性，抑制再灌注后氧自由基的过度生成，进而发挥其保护效应. 在对缺血再灌注的保护作用中，缺血后处理与川芎嗪治疗二者在抗氧化损伤方面无明显差异.
   
　

【】
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