HBV对肝癌细胞中mmp?2及nm23表达的影响
【摘要】 目的: 研究mmp?2和nm23在无HBV表达的人肝癌细胞株HepG2和持续表达HBV的HepG2细胞株（HepG2.215）中的表达及差异，进一步了解HBV在肝癌侵袭转移中的作用. 方法: 通过免疫细胞化学、Western Blot检测两组细胞株HepG2和HepG2.215中mmp?2和nm23的表达. 结果: 肝癌细胞株HepG2.215与HepG2细胞株相比较，其mmp?2表达的水平明显升高(P<0.01)，而nm23表达的水平却明显下降(P<0.01). 结论: mmp?2和nm23的表达水平能反映肝癌的侵袭转移能力. mmp?2在HepG2.215中的高表达和nm23在HepG2.215的低表达，可提示长时间的HBV感染可能会改变转移相关基因的表达，且有可能会导致肝癌细胞扩散转移.
【关键词】 肝肿瘤；肝炎病毒，2型；hepG2.215；hepG2；肿瘤转移
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of nm23 and mmp?2 in HepG2 cells and HepG2.215 cells which persistently expresses hepatitis B virus by integrated HBV genome with HepG2, and to further understand the function of HBV in invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: The expressions of mmp?2 and nm23 proteins were determined by immunocytochemistry and western blot in the HCC cell lines. RESULTS: Compared with HepG2 cells, the expression of mmp?2 protein increased, and that of nm23 protein decreased in HepG2.215 cells. CONCLUSION: The expressions of nm23 and mmp?2 protein in HCC may reflect the metastasis potential of hepatocellular carcinoma. There is a marked difference in the expression rate of nm23 to mmp?2 between the HepG2.215 cells and HepG2 cells. The results indicate a possibility that long time HBV infection could induce the expression profile of metastasis inhibitors, furthermore, cause the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma.
【Keywords】 liver neoplasms; hepatitis B virus; HepG2.215； HepG2； neoplasm metastasis
0 引言
目前研究认为肝癌在其侵袭、转移的过程中必须具备降解细胞外基质的能力. mmp?2与多种肿瘤的浸润侵袭有关［1］. 在肝癌侵袭转移过程中，其表达产物不仅可以酶解细胞间基质成分，还能酶解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原. 而nm23作为第一个被发现的抑癌基因，与多种人类肿瘤的侵袭、转移相关［2］. 本实验拟通过研究转移相关基因mmp?2与nm23在人肝癌细胞株HepG2和持续表达HBV的HepG2细胞株（HepG2.215）中的表达及差异,进一步阐述HBV在肝癌浸润、转移中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 新生牛血清、DMEM低糖培养基购自GIBIO公司. MaxVisionTM快速免疫组化方法二步法检测试剂盒，DAB染色盒购于迈新公司，nm23鼠抗人单克隆抗体，mmp?2兔抗人多克隆抗体均购自美国Novus公司，HRP标记的人抗兔单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，PVDF膜和ECL发光液均购自Pierce公司. 其余试剂为国产分析纯级.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人肝肿瘤细胞株HepG2由第四军医大学西京病理科提供，持续表达HBV的HepG2细胞株（HepG2.215）由第四军医大学唐都医院传染科提供. HepG2, HepG2.215细胞均为贴壁细胞，用含100 mL/L新生牛血清的DMEM低糖培养基在37℃,饱和湿度及50 mL/L CO2的细胞培养箱内传代培养.
1.2.2 免疫细胞化学 培养细胞于12孔板，处理细胞后4%多聚甲醛固定并透化处理，PBS充分清洗后，100 mL/L羊血清封闭，免疫细胞化学检测前采用10g/L Triton?X?100 破膜30 min，30 mL/L H2O2阻断内源性过氧化物酶20 min,分别加入1∶80 nm23鼠抗人单克隆抗体及1∶80 mmp?2 兔抗人多克隆抗体后,放置湿盒中，4℃冰箱过夜.其余步骤参照迈新公司免疫组化染色步骤说明书. 显微镜下观察细胞并拍照.
1.2.3 免疫印迹（Western Blot） 培养细胞于6孔板，裂解细胞并BCA试剂盒蛋白定量后，SDS?PAGE系统电泳转膜，封闭后加入一抗，包括mmp?2鼠抗人单克隆抗体（1∶1000），nm23兔抗人多克隆抗体（1∶1000），β?actin鼠抗人单抗体（1∶2000），4℃过夜. 二抗为HRP标记人抗兔抗体（1∶1000 ）室温2 h. DAB 显色,结果拍照,扫描.
1.3 观察指标 阳性结果判定： 以在肿瘤细胞中出现棕黄色颗粒为准在高倍镜(×400)下随机选取5个不同视野观察,分别计数视野中的阳性细胞数及细胞总数.
统计学处理： 实验数据用x±s表示，用Labimage统计软件进行组与组之间单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 mmp?2, nm23在HepG2.215及HepG2肝癌细胞中的表达 mmp?2，nm23均为细胞胞浆抗原，与特异性抗原抗体及显色反应发生于细胞浆，以在肿瘤细胞、间质细胞胞质中出现棕黄色颗粒，判定为阳性结果. 通过细胞免疫化学染色可以证实mmp?2在 HepG2.215中的阳性率（57/80，71.25%）高于在HepG2中的阳性率（36/80，45.00%，P<0.05），nm23在 HepG2.215中的阳性率（18/80，22.25%）低于在HepG2中的阳性率（18/80，22.25%，P<0.05，图1A，B，图2A，B）.
A： mmp?2; B： nm23.
图1 mmp?2，nm23在HepG2.215肝癌细胞中的表达 MaxVisionTM法×400（略）
2.2 mmp?2，nm23在HepG2.215及HepG2中蛋白表达差异 在HepG2.215细胞中mmp?2的蛋白表达较HepG2细胞明显升高，而nm23的蛋白表达较HepG2细胞明显降低（图3，4）.
A： mmp?2; B： nm23.
图2 mmp?2，nm23在HepG2肝癌细胞中的表达 MaxVisionTM法 ×400（略）
图3 Western Blot 检测mmp?2，nm23在HepG2.215及HepG2中蛋白表达（略）
bP<0.01 vs HepG2.215.
图4 Labimage软件进行统计分析结果图（略）
3 讨论
浸润和转移是恶性肿瘤的重要特征，也是影响疾病治愈率和预后的主要因素. mmp?2与多种肿瘤的浸润侵袭有关，在肝癌以及慢性肝炎肝组织中均表达增强［3］. 在肝癌侵袭转移过程中，其表达产物不仅可以酶解细胞间基质成分还能酶解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原. 研究表明，nm23基因的mRNA水平与肿瘤细胞的转移呈负相关，也是抑制转移的主要分子机制［4］. 其可以作为评估肿瘤的转移和患者预后的指标［5］.
流行病学调查显示： 我国大约有80%的肝癌与乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV）感染有关，乙型肝炎病毒（HBV）感染的严重后果是发生肝细胞肝癌（HCC）. HBV?DNA整合入肝细胞的重要作用是在某些情况下增加宿主基因的不稳定性,从而干扰或启动那些对细胞生长和变异有重要作用的细胞基因. 而且HBV?DNA的表达产物可能对细胞功能有直接作用,其中有些还可以促使肝细胞癌变. 另外，在被感染的组织中可发现被截短的pre?S2/S，HBx和一些新的基因表达产物,这些基因表达产物可通过对细胞生长和凋亡的影响而促进HCC发生.
Lara?Pezzi等［7］在体外与体内试验中证实HBx通过诱导膜基质金属蛋白酶?1（mt1?mmp）和环氧和酶（COX?2）的表达促进肿瘤细胞侵袭. 鸡胚绒毛膜尿囊（CAM）侵袭测定HBx诱导mt1?mmp表达，mt1?mmp在细胞表面激活明胶酶原A（mmp?2）,mmp?2降解Ⅳ型胶原（基底膜的主要成分），突破内皮细胞屏障，达到血液，向远处转移.在HCC患者中发现mmp?2的活性与HCC的转移和复发有关；COX?2能调节mt1?mmp的表达与mmp?2的活化，HBx能在mRNA和蛋白质水平上调节COX?2的表达HBx通过NF?AT依赖方式激活COX?2基因启动子转录来上调COX?2的表达，从而调节mt1?mmp的表达与mmp?2的活化［8］. nm23 基因通过编码NDPK参与多种生物学过程. NDPK通过将5′NTP 的γ磷酸基因转移到5′NDPK 上,使nm23 蛋白变为失活状态,从而调节细胞信号传递,导致有利于异常分化和肿瘤转移的紊乱状态［9］. 从而起到抑制肿瘤转移的作用.
我们研究了肝癌细胞株（HepG2.215，HepG2）细胞转移相关因子的表达情况. 发现持续表达HBV的HepG2细胞株与原始细胞株相比其转移促进基因mmp?2表达增强，而转移抑制基因nm23表达减弱. 这些结果提示长时间的HBV感染可能会上调促转移基因的表达以及下调转移抑止基因，从而导致肝细胞肝癌的浸润和转移. 国外已有此方面的研究，但机制仍不十分清楚［6，10］. 肝癌的转移是一个多基因、多步骤的过程，而HBV病毒是如何触发转移相关因子的表达改变目前仍不明确，还需进一步深入研究.
【】
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