益肾活血胶囊对同型半胱氨酸致兔动脉粥样硬化MCP?1mRNA表达及NFκB活化的影响

【摘要】  目的 探讨益肾活血胶囊对同型半胱氨酸（Hcy）致兔动脉粥样硬化（AS）单核细胞趋化蛋白?1（MCP?1）基因表达及核因子?κB（NF?κB）活化的影响。方法 将40只新西兰兔随机分为正常组、模型组、益肾活血胶囊小剂量组、益肾活血胶囊大剂量组及西药（叶酸、维生素B6、维生素B12）组，除正常组外，其他组建立高Hcy血症及AS动物模型，然后分别给予相应的药物。采用高效液相色谱技术检测血浆Hcy浓度、HE染色观察血管形态学变化、实时定量PCR检测动脉壁MCP?1基因表达、Western blot分析核因子?κB抑制因子α（IκBα）蛋白含量。结果 益肾活血胶囊和叶酸等维生素均可明显降低血浆Hcy水平（P＜0.01），抑制血管内膜增厚，下调腹主动脉MCP?1基因表达（P＜0.01），增加IκBα蛋白含量（P＜0.01）。益肾活血胶囊大剂量组疗效明显优于小剂量组和西药组（P＜0.05）。结论 益肾活血胶囊可明显降低血浆Hcy水平，抑制Hcy诱导的动脉粥样硬化的形成，其机制可能与下调MCP?1基因表达，抑制NF?κB活化有关。

【关键词】  益肾活血胶囊；同型半胱氨酸；动脉硬化；单核细胞趋化蛋白?1；核因子?κB;核因子?κB抑制因子α

　　To explore the effects of the Yishenhuoxue capsule (YC) on aortic monocyte chemoattractant protein?1 (MCP?1) mRNA expression and nuclear factor?kappaB (NF?κB) activation in atherogenesis of hyperhomocysteinemic rabbits. Methods  Forty male New Zealand white rabbits were divided into five groups: the control, the model, the low dose YC, the high dose   YC and the western medicine (folic acid, VitB6 and VitB12) group. Apart from the control group, rabbits in other groups underwent balloon catheter injuries and a high methionine diet to induce hyperhomocysteinemia and atherosclerosis by treatment with different drugs. Plasma Hcy concentration, aortic morphological changes, MCP?1 mRNA expression and expression of inhibitor of nuclear factor?kappaB (IκBα) protein in the abdominal aorta were respectively determined by high performance liquid chromatography, HE staining, real?time quantitative PCR and western blot. Results  Both YC and western medicine could decrease the plasma Hcy concentration（P＜0.01), attenuate the intimal thickening, down?regulate the MCP?1 mRNA expression（P＜0.01) and increase the IκBα protein expression（P＜0.01). The efficacy of YC at a high dose was superior to that of YC at a low dose and western medicine（P＜0.05). Conclusions  YC decreases the plasma Hcy level and subsequently

　　同型半胱氨酸（Hcy）是一种含巯基氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物。近年研究表明［1?2］血浆Hcy浓度升高是动脉粥样硬化（AS）及血栓栓塞性疾病的独立危险因素。Hcy致AS的机制与其诱发血管壁炎症反应有关［3］。本研究以高蛋氨酸饮食诱导兔高Hcy血症并制备AS动物模型，探讨中药益肾活血胶囊对Hcy致血管壁炎症的抑制作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验动物与药物

　　雄性纯种新西兰大白兔40只，体重2.0～2.5?kg，购自山东省农业院。益肾活血胶囊由山东大学齐鲁中医科研制，本院制剂室提供，药物组成：枸杞子、丹参、生黄芪、黄精、川芎、水蛭、瓜蒌皮、大黄、黄连等。

　　1.1.2  仪器与试剂

　　主要仪器：Olympus BX51型显微镜（Olympus Corporation，Japan）；Image Pro Plus 5.0数字图像分析系统（Media Cybernetics，USA）；Tgradient 96型PCR热循环仪（Whatman Biometra，Germany）；LightCycler型荧光实时定量PCR系统（Roche Diagnostics，Germany）。主要试剂：同型半胱氨酸购自Sigma公司；鼠抗人IκBα单克隆抗体购自Santa Cruze公司；羊抗小鼠IgG抗体购自北京中山生物技术有限公司；Trizol、Oligo dT和dNTP购自Invitrogen公司；M?MLV购自Promega公司；荧光实时定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq TM)购自Takara公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  实验分组及给药

　　随机从40只新西兰兔中选取8只为正常对照组，给予普通饲料喂养。余32只随机平分为模型组、益肾活血胶囊小剂量组(中药小剂量组)、益肾活血胶囊大剂量组(中药大剂量组)及西药组，均根据陈文强等［4］方法以球囊损伤腹主动脉内膜联合2％蛋氨酸饲料喂养20周，制备高Hcy血症及AS模型。其中药物治疗组在实验12周后，高蛋氨酸饲料继续喂养的同时，给予下列不同处理8周。中药小剂量组：给予益肾活血胶囊260?mg/kg灌胃，1次/d；中药大剂量组：给予益肾活血胶囊1?300?mg/kg，1次/d；西药组：给予联合用药叶酸0.49?mg/kg、VitB12 2.47?μg/kg、VitB6 0.49?mg/kg，1次/d。

　　1.2.2  血浆Hcy浓度测定

　　实验结束时每只动物采血2?mL，EDTA?Na2抗凝，30?min内4?℃ 3?000?r/min（离心半径10?cm）离心15?min，分离血浆，-80?℃冻存，以高效液相色谱法检测血浆Hcy浓度。

　　1.2.3  病理形态学观察

　　末次给药后24?h禁食，不禁水，3％戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉。快速打开腹腔剥离腹主动脉，剪取约0.5?cm腹主动脉，10％中性福尔马林固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，4?μm连续切片，苏木素-伊红染色后于光镜下观察。余腹主动脉-80?℃保存。

　　1.2.4  总RNA提取及cDNA合成

　　取约1?cm冻存的腹主动脉，按Trizol试剂说明书提取组织总RNA，用紫外分光光度仪测OD260/OD280，所有标本该值均在1.7～2.0之间。用Oligo dT、dNTP和M?MLV在PCR热循环仪上将RNA逆转录为cDNA,反应条件为42?℃ 60?min，95?℃ 5?min。

　　1.2.5  荧光实时定量PCR检测单核细胞趋化蛋白?1(MCP?1)mRNA含量

　　兔MCP?1与内参基因GAPDH引物由上海博亚公司（BioAsia）合成，引物序列为：MCP?1(125?bp) 上游5′?TGACCCCAAGCAGAA
GT?3′下游5′?TCCGGGTGGAAGATAAAT?3′；GAPDH(180?bp) 上游5′?CATCATCCCTGCCTCCACT?3′下游5′?GCCTGCTTCACCACCTTCTT?3′。反应体系：cDNA 1?μL，上下游引物各1?μL，SYBR Green I 10?μL，加水至20?μL。反应条件：95?℃预变性10?s，58?℃（MCP?1）或64?℃（GAPDH）退火5?s，72?℃延伸10?s，共45个循环，最后40?℃ 30?s结束反应。采用Livak［5］报道的2-ΔΔCt方法对MCP?1mRNA表达进行相对定量分析。

　　1.2.6  Western blot检测IκBα蛋白含量

　　提取蛋白并定量，经聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白，电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维膜上，封闭，加一抗，辣根过氧化物酶标记二抗，化学发光试剂增强反应，X线片压片曝光，经光密度仪扫描分析，IκBα蛋白表达量。

　　1.3  统计学处理

　　实验数据以±s表示，组间差异采用one?way ANOVA分析和q检验。所有数据资料均采用SPSS 13．0进行统计处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2.1  血浆Hcy浓度变化

　　见表1。由表1可见，与对照组相比，模型组血浆Hcy浓度明显升高（P＜0.01）；经中药益肾活血胶囊及西药叶酸、VitB6、VitB12，血浆Hcy浓度均较模型组明显降低（P＜0.01）。中药大剂量组血浆Hcy水平明显低于西药组（P＜0.01）。表１血浆Hcy浓度(略)

　　2.2  组织形态学变化

　　见图1。HE染色示正常组血管壁内膜光滑、完整、无增厚；模型组兔血管内膜均明显增厚，内皮下可见泡沫细胞聚集，其中两只兔子血管可见明显的粥样斑块形成；经益肾活血胶囊和西药治疗，血管内膜增厚均明显减轻，中药大剂量组明显优于中药小剂量及西药组。

　　2.3  MCP?1mRNA的表达结果

　　见图2。根据核酸扩增过程的S型动力学曲线，结合溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳，判定为特异性扩增。数据分析采用2-ΔΔCt方法［5］，结果显示，模型组腹主动脉MCP?1mRNA表达显著增高，是对照组的10.34倍（P＜0.01）；益肾活血胶囊和叶酸等维生素治疗组MCP?1mRNA表达量分别下降至正常组的7.06倍（中药小剂量组）、5.62倍（中药大剂量组）和7.67倍（西药组），其差异有统计学意义（P＜0.01）。其中中药大剂量组与小剂量组和西药组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

　　2.4  IκBα蛋白表达

　　见图3。Western blot分析显示，模型组兔腹主动脉IκBα蛋白含量较正常组明显降低（P＜0.01），说明高Hcy血症诱导了IκBα的降解，促进了NF?κB活化。经益肾活血胶囊和叶酸等维生素治疗，IκBα蛋白含量明显回升，与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），说明二药均可降低NF?κB的活化。其中中药大剂量组与小剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

　　3  讨  论

    同型半胱氨酸(Hcy)是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢过程中的重要中间产物。轻中度高Hcy血症是AS的独立危险因素。其机制与损伤血管内皮功能、促进平滑肌细胞增殖、影响血液的凝固性及诱发血管壁炎症反应等有关［6］。叶酸、VitB6和VitB12是同型半胱氨酸代谢的重要辅因子，是临床常用的降低血浆Hcy浓度的药物，本研究以此为阳性对照，通过观察用药后血浆Hcy浓度及动脉壁炎性因子表达量的变化，探讨益肾活血胶囊降低血浆Hcy水平及抗AS的作用机制。结果表明，益肾活血胶囊可明显降低血浆Hcy浓度，抑制Hcy所致的血管壁炎症反应，其疗效优于叶酸等维生素治疗组。

    趋化因子MCP?1介导的外周血单核细胞、淋巴细胞向血管内皮粘附与浸润是AS形成的早期事件。Wang等［7］研究发现，高Hcy血症可明显促进血管内皮MCP?1表达，增加单核细胞与内皮的粘附。体外实验研究亦表明，Hcy可诱导内皮细胞、平滑肌细胞表达MCP?1［8?9］。本实验结果显示，高Hcy血症兔血管MCP?1mRNA表达显著增多。经益肾活血胶囊治疗，血浆Hcy浓度及血管MCP?1mRNA的表达较模型组显著降低，血管内膜增厚亦明显减轻，疗效优于叶酸等维生素治疗组，说明益肾活血胶囊在降低血浆Hcy浓度的同时，尚可抑制炎性细胞向血管壁的粘附，从而减轻Hcy对血管的损害。

    核因子?κB(NF?κB)是调节趋化因子、粘附分子、生长因子等表达的重要转录因子，参与炎症过程中的多种信号传导途径，与AS的发生、密切相关［10］。NF?κB在细胞中主要以p50/p65二聚体形式存在，其中p65亚基含有DNA活化域。细胞处于静息状态时，抑制蛋白IκB与p50/p65二聚体结合，p65亚基上的核定位信号被IκB覆盖，导致p50/p65二聚体不能进入细胞核内。当NF?κB的诱导剂作用于细胞后，IκB被IκB激酶磷酸化，随后迅速被蛋白酶降解，释放出“游离态”的p50/p65二聚体，p50/p65二聚体转移入细胞核引起靶基因表达。在这一信号通路中，IκB的磷酸化和降解是NF?κB活化的关键步骤［11］。本研究结果显示，高Hcy血症及AS兔血管IκBα蛋白含量较
正常兔明显降低，提示Hcy促进了NF?κB活化。Wang等［9］研究发现，Hcy引起的MCP?1基因表达增加主要是通过NF?κB活化实现的。益肾活血胶囊可明显抑制IκBα的降解，推测该药是通过抑制NF?κB活化降低趋化因子MCP?1的表达。NF?κB是一个对细胞氧化还原状态敏感的转录因子，有研究表明［12］，NF?κB的激活可以被多种抗氧化剂抑制。杨瑞雪等［13］研究显示，益肾活血胶囊可明显升高高Hcy血症大鼠血浆SOD含量，降低MDA水平，具有抗氧化的功能，这可能是益肾活血胶囊抑制Hcy致AS的更深一层机制。本研究结果显示，益肾活血胶囊可明显降低血浆Hcy水平，延缓AS的发生与发展，其机制可能是通过抑制NF?κB活化，下调MCP?1基因表达，从而抑制炎性细胞的粘附而发挥抗AS作用的。

【】
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