没药倍半萜成分的分离鉴定及抗肿瘤活性

【摘要】  目的 从没药提取物中分离纯化倍半萜单体成分，并探讨其抑制肿瘤细胞增殖的生物活性。方法 没药石油醚提取部分经硅胶柱层析分离得到二十多个倍半萜类化合物。其中化合物1和2的结晶分别经熔点测定、薄层层析、1H?NMR和13C?NMR数据分析以及与已知化合物比较，确定其化学结构。 利用MTT法检测化合物1和2对大肠癌细胞HT?29和激素非依赖型前列腺癌细胞PC?3、PC?3M、DU?145及正常肝的永生化细胞LO2细胞增殖的影响。结果 经理化性质鉴定、波谱分析，确定化合物1的结构为［1(10)E,2R,4R］?2?甲氧基?8,12?环氧吉玛?1(10),7,11?三烯?6?酮；化合物2的结构为2?甲氧基?5?乙酰基?4?呋喃吉玛?1(10)?烯?6?酮，二者同属没药吉玛烷型倍半萜类化合物。MTT结果表明，化合物1和2对大肠癌细胞增殖的抑制作用较弱。而对三种激素非依赖型前列腺癌细胞的增殖有非常显著的抑制作用（P＜0.01），且呈剂量依赖性。另外，化合物对正常肝永生化细胞的增殖无明显影响。结论 经分离纯化、理化性质鉴定和波谱分析，确定了没药吉玛型倍半萜化合物1和2的结构，该化合物对前列腺癌细胞的增殖有明显的抑制作用。

【关键词】  没药；吉玛烷型倍半萜；前列腺癌；细胞株

　　To determine the structures of two sesquiterpene compounds isolated from Commiphora opobalsamum, and to investigate its their anti?proliferation effect on tumor cell growth. Methods  Two sesquiterpenoids were isolated from the resinous exudates of Commiphora opobalsamum. Their structures were established on the basis of physical and chemical properties, and 1H?NMR and 13Results  Structures of two sesquiterpenoids were determined as (1(10)E,2R,4R)?2?methoxy?8, 12?epoxygermacra?1(10), 7, 11?trien?6?one and 2?methoxy?5?acetoxy?furanogermacr?1(10)?en?6?one.  The results of MTT assay showed that both compounds had an inhibitory effect on the proliferation of hormone?independent prostate cancer cell lines in a concentration?dependent manner. No significant anti?proliferation activity was observed in colorectal cells exposed to these chemicals at low concentrations. Furthermore, less cytotoxicity of these compounds was shown by using the immortalizied liver normal cell line at concentrations tested. Conclusions  The structure of two germacrane sesquiterpenoids were identified, and they can significantly inhibit the proliferation of hormone?independent prostate cancer cell growth.

　　Key words:  Myrrh； Germacrane Sesquiterpenoids； Prostate neplasms； Cell lines
 
    没药（myrrh）为没药属植物树皮渗出的胶状树脂，为临床常用中药，具有行气散血、消肿止痛等功效，有悠久的药用。国内外对没药化学成分和生物活性研究颇为关注，已分离鉴定了300多个代谢产物，包括萜类、甾体、黄酮、木脂素等化学成分。没药中含有丰富的倍半萜成分，其骨架类型多样，已发现吉玛烷型，桉烷型，愈创木烷型等倍半萜结构120多个，并含有大量呋喃倍半萜。其倍半萜类成分具有麻醉、抗菌、抗高血糖等活性［1?2］。近年的研究对没药的抗肿瘤活性给予了充分肯定［3?5］，提出呋喃型没药倍半萜成分可下调抗凋亡基因Bcl?2的表达。

    本研究将Commiphora opobalsamum没药进行粗分，得到挥发油I、石油醚、三萜粗提物三部分，并检测粗提物对肿瘤细胞增殖的影响。结果发现其石油醚部位和三萜粗提物具有细胞毒活性。通过对有活性的石油醚部位进行成分的细分离，得到倍半萜粗提物，进一步分离得到20多个倍半萜成分，分别属于吉玛烷型、愈创木烷型等。本实验将对其中含量较高的2个吉玛烷型倍半萜化合物（sesquiterpenoid 1和2, 分别简称ST1，ST2）进行进一步抑瘤活性筛选，探讨其对癌细胞尤其是前列腺癌细胞增殖的影响，为进一步研究开发没药活性成分奠定了基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  药材收集和鉴定

　　没药药材为2004年9月委托山东省中医药大学附属药房从印度购买。经沈阳药科大学药用植物研究室孙启时教授鉴定为爱伦堡没药，拉丁名Balsamodendron ehrenbergianum Berg. 即Commiphora opobalsamum。标本保存于山东大学药学院天然药物化学教研室，标本号：20020910CO。

　　1.2  仪器与试剂

　　核磁共振由山东大学药学院分析测试中心采用Bruker Avance 600 型核磁共振波谱仪代为测定。熔点采用X?6显微熔点测定仪(北京泰克仪器厂)测定。薄层层析用硅胶(Silica gel GF254和H)及柱层析用硅胶(200?300目)均由青岛海洋化工厂生产；溶剂为分析纯。

　　1.3  提取和分离

　　没药(4.5?kg)粉碎，索氏提取器石油醚提取24?h，常压浓缩得石油醚浸膏500?g，硅胶柱层析，以PE?EtOAc系统梯度洗脱(EtOAc含量从0到100％)，得到8个组分Fr.A?H。取Fr. C硅胶柱层析，PE?EtOAc(95∶5)洗脱，得化合物2 (ST2，126.3?mg)和三个部分Fr.C ?(1?3)。Fr.C?2经快速柱层析(FLC),以PE?EtOAc(94∶6)洗脱，经Sephadex LH?20纯化得化合物1(ST1，10.8?mg)。准确称取少量ST1和ST2溶于二甲基亚砜（DMSO）中，分装后保存于-20?℃备用。

　　1.4  细胞培养

　　人前列腺癌细胞株PC?3、PC?3M、DU?145和大肠癌细胞株HT?29由本室保存。细胞按常规方法培养在75?mL的培养瓶中，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液于37?℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养2?d后，细胞接种至96孔板中继续培养至密度达到50%～70%，更换不含血清的培养液，继续培养24?h，以除去内源性的甾体激素。将培养液更换为含有经活性炭处理的5%胎牛血清（除去内源性激素），用于实验。细胞分为空白对照组（未经任何处理）和药物处理组（加入ST1、ST2）

　　1.5  MTT法细胞增殖实验
 
　　药物处理组的培养液中分别加入不同浓度的溶于DMSO的ST1、ST2，HT?29的药物浓度分别为5、20、80?μmol/L，PC?3、PC3M、DU?145的药物浓度分别为40、60、80?μmol/L，对照组细胞中加入最大浓度组所需DMSO量等体积的DMSO。细胞经药物处理24?h后加MTT，4?h后吸出上清，加入DMSO测定样品的吸光度，根据吸光度值大小检测细胞增殖情况。如对细胞增殖有抑制作用,抑制率。抑制率=（A对照-A药物）/A对照×100%。

　　2  结  果

　　2.1  化合物结构解析

　　2.1.1  化合物1（ST1）

　　无色片状结晶(PE)，m.p. 83～84?℃，以PE?EtOAc(8∶1)薄层展开，Rf为0.41，喷10% H2SO4?EtOH加热后显单一的灰色斑点。13CNMR谱中有16个碳信号（见图1），推测该化合物可能是倍半萜，其中六个双键碳信号(δ　151.7、 137.5、 133.5、 133.2、 126.1和119.8)和一个羰基信号(δ 202.5)。1HNMR谱中有4个甲基信号，其中δ 3.27(s)为甲氧基，δ 1.92(s)和1.80(s)与双键相连，而δ 1.13(d，J＝7.2?Hz)的甲基与叔碳相连；由δ 7.02(1H, br s)和1.91(3H, d, J=0.75?Hz)氢信号，推断分子中有呋喃环，两信号分别为α位氢和β位甲基。将其1H和13C NMR数据与［6］对照，完全一致，确定该化合物为［(1(10)E,2R,4R)］?2?甲氧基?8,12?环氧吉玛?1(10),7,11?三烯?6?酮［1(10)E,2R,4R］?2?methoxy?8,12?epoxygermacra?1(10)7,11?trien?6?one。

　　2.1.2  化合物2（ST2）

　　无色柱状结晶(PE?EtOAc)，m.p. 115～117?℃，以PE?EtOAc(8∶1)薄层展开，Rf为0.33，喷10% H2SO4? EtOH溶液加热后显绿色斑点。13CNMR谱显示分子中有18个碳信号（图2），包括一个孤立羰基(δ 195.5)和一个酯基(δ 170.1)；根据δ154.3、138.0、135.1、132.8、123.2和121.2的碳信号可推断出分子中存在三个双键；由δ79.1、73.9和55.7的碳信号推断出该分子中有三个连氧的饱和碳。1HNMR中有5个甲基信号，其中δ3.26(s)是甲氧基的信号，δ2.04(s)、1.92(s)和1.94(s)三个甲基与不饱和季碳相连，δ1.10(d，J=3.7?Hz)甲基与饱和叔碳连接；由δ7.04(s)推测分子中有呋喃环。将其13CNMR数据与文献［7］报道数据比较，确定为2?甲氧基?5?乙酰基?4?呋喃吉玛?1(10)?烯?6?酮［2?methoxy?5?acetoxy?furanogermacr?1(10)?en?6?one］。

　　2.2.1  化合物1（ST1）

　　［1(10)E,2R,4R］?2?甲氧基?8,12?环氧吉玛?1(10),7,11?三烯?6?酮［1(10)E,2R,4R］?2?methoxy?8,12?epoxygermacra?1(10),7,11?trien?6?one, C16H22O3; Colorless flakes (PE); m.p. 83～84?℃;1HNMR(CDCl3, 600?MHz) δ: 7.02(1H, br s, H?12), 5.24(1H, d, J=8.3?Hz, H?1), 4.01(1H, dt, J=8.6, 2.4?Hz, H?2), 3.55(1H, d, J=14.9?Hz,  H?9a), 3.27(3H, s, H?16), 3.20(1H, d, J=14.4?Hz, H?9b), 2.54(2H, m, H?5), 2.40(1H, m, H?4), 1.99(1H, m, H?3a), 1.91(3H, d, J=0.75?Hz, H?13), 1.80(3H, d, J=1.03?Hz, H?15), 1.76(1H, m, H?3b), 1.12(3H, d, J=7.1?Hz, H?14);13CNMR(CDCl3, 150?MHz) δ: 202.5(C?6), 151.7(C?8), 137.5(C?12), 133.5(C?10), 133.2(C?1), 126.1(C?11), 119.8(C?7), 74.8(C?2), 55.6(C?16), 50.7(C?5), 38.4(C?9), 37.2(C?3), 25.4(C?4), 22.1(C?14), 18.1(C?15), 8.3(C?13)。

　　2.2.2  化合物2（ST2）

　　2?甲氧?5?乙酰基?4?呋喃吉玛?1(10)?烯?6?酮［2?methyoxy?5?acetoxy?4?furanogermacr?1(10)?en?6?one］, C18H24O5; Colorless column crystals; m.p.115～117?℃;1H NMR(CDCl3, 600?MHz) δ: 7.04(1H, s, H?12), 5.54(1H, br s, H?5), 5.27(1H, br s, H?1), 4.14(1H, m, H?2), 3.64(1H, d, J=16.4?Hz, H?9a), 3.32(1H, d, J=16.9?Hz, H?9b), 3.26(3H, s, H?16), 2.39(1H, m, H?4), 2.04(3H, s, H?18), 1.95(1H, m, H?3a), 1.93(3H, br s, H?15), 1.93(3H, br s, H?13), 1.91(1H, m, H?3b), 1.10(3H,d, J=7.0?Hz, H?14);13〖KG*3]CNMR(CDCl3, 150?MHz) δ: 195.5(C?6), 170.1(C?17), 154.3(C?8), 138.0(C?12), 135.1(C?10), 132.8(C?1), 123.2(C?11), 121.2(C?7), 79.1(C?5), 73.9 (C?2), 55.7(C?16), 30.7(C?4), 37.8(C?3)a, 38.2(C?9)a, 20.6(C?18)b, 18.8(C?14)b, 17.4(C?15)b, 8.6(C?13)。

　　2.3  ST1和ST2对大肠癌细胞HT?

　　29增殖的影响  见图3。由图3可见，ST1的药物浓度在5、20?μmol/L时，与空白对照组差异无统计学意义；当药物浓度在80?μmol/L时，细胞增殖情况较空白对照组降低（P＜0.01）。ST2与ST1药物的作用相似，但ST2的药物浓度在20?μmol/L时对细胞的增殖有抑制作用。上述结果表明，ST1、ST2在较高浓度下对HT?29细胞的增殖有一定的抑制作用，但抑制率较低。

　　2.4  ST1和ST2对激素非依赖性前列腺癌细胞PC?3增殖的影响

　　由ST1和ST2对大肠癌细胞增殖的抑制作用分析，推断该组化合物可能的有效浓度需大于20?μmol/L。因此本研究采用40、60、80?μmol/L浓度观察其对PC?3细胞增殖的影响，见图4。由图4可见，ST1能够抑制PC?3细胞的增殖，且随着剂量的增加，其抑制作用更加显著，呈剂量依赖性。ST2对PC?3细胞增殖的抑制作用与ST1相似，呈明显的剂量依赖性，较ST1的抑制作用强，抑制率见表1。

　　2.5  ST1和ST2对激素非依赖性前列腺癌细胞PC?3M和DU145增殖的影响

　　见图5A。ST1和ST2均能显著抑制PC?3M细胞的增殖，且呈剂量依赖性。与图4的结果相似，ST2较ST1亦有较强的抑制作用，抑制率见表1。药物对DU145细胞增殖的影响如图5 B所示，二者均能非常显著的抑制细胞的生长，其抑制率与对PC?3细胞的抑制率相近，见表1。

　　2.6  ST1和ST2对正常肝永生化细胞增殖的影响

　　由于难以获得正常的人前列腺细胞，本研究采用正常肝永生化细胞LO2为对照，检测药物对正常细胞增殖的影响，结果见图6。由图6可见，在实验浓度范围内，ST1和ST2对LO2细胞的增殖并无明显的影响，当ST1和ST2的浓度为80?μmol/L时，对细胞的增殖有一定的抑制作用，ST1的作用较为明显。

　　3  讨  论

    没药在我国、希腊、印度等国家有悠久的药用。我国清代王洪绪所著《外科全生集》中的犀黄丸方为中医经典方，含有牛黄、麝香、乳香和没药四味药材。临床资料表明，犀黄丸对晚期肝癌、胆管癌、胰腺癌等具有良好的效果。作为临床的常用中药，其药效成分及作用机制为现代药所关注，也获得了许多具有多种生物活性没药次生代谢产物。例如，以MCF?7细胞株为测试对象，利用活性追踪的方法从C. wightii中分离得到了两个长链脂肪醇阿魏酸衍生物形成的混合物，对MCF?7和P388肿瘤细胞株半数抑制浓度(IC50)均为25?μmol/L，进一步研究表明其能够抑制P?糖蛋白介导的肿瘤多药耐药性［8］。Shoemaker等［5］测定了C. myrrha水提取物对8种肿瘤细胞株（包括A549、LLC、Panc?1、Panc02、MCF?7、MCNeuA、PC?3和LNCaP）的生长抑制作用，除LNCaP细胞株外，生长抑制率均大于75%，而对正常细胞无抑制作用。本研究自没药C. opobalsamum中分得20多个倍半萜类化合物，并对其中含量较高的2个吉玛烷型倍半萜化合物进行抗肿瘤活性筛选。结果表明，倍半萜类化合物对三种激素非依赖性前列腺癌细胞的增殖均有显著的抑制作用，在高浓度下对大肠癌细胞的增殖有抑制作用。呋喃型没药倍半萜成分可下调抗凋亡基因Bcl?2的表达，对细胞增殖抑制明显，ST1与ST2是否通过同一分子机制抑制细胞增殖，仍需进一步实验探讨。另外，实验结果还显示，ST2对前列腺癌细胞增殖的抑制作用比ST1强。从二者的结构分析得知，ST2与ST1具有相同的结构骨架，前者较后者在C5位多一个乙酰基团。有关其构效关系，还需通过实验加以证实。没药倍半萜抑制前列腺癌细胞增殖的生物活性，将对于开发治疗前列腺癌尤其是激素非依赖性的前列腺癌的药物提供新的资料。其具体分子机理尚需进一步探讨。

【】
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