骨炎定方对一氧化氮抑制人骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原合成的影响
作者：郑晓辉 周琦石 王海彬 黄枫 陈基长
【关键词】 软骨细胞
摘要：［目的］观察骨炎定方对一氧化氮抑制离体人骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原合成的影响，探讨中医药补肾益气行血法保护软骨细胞的作用途径。［方法］髋关节炎行关节置换术中获取离体股骨头关节软骨，行软骨细胞分离培养传代，通过设立空白血清对照组，IL1组、IL1加NAME组、补肾益气行血法中药骨炎定方含药血清组加入传代软骨细胞，采用MTT法于不同时间测定软骨细胞增殖影响，并运用逆转录聚合酶链技术检测对软骨细胞一氧化氮合酶(iNOS)和Ⅱ型胶原mRNA的影响。［结果］骨炎定方含药血清组在不同时间段均有促进软骨细胞增殖的作用。和对照组相比，3组(IL1组、IL1加NAME组、IL1+骨炎定方含药血清组)均明显了增加iNOS mRNA的表达，但加入NAME组及骨炎定方含药血清组和IL1组相比，可以抑制iNOS mRNA的表达，和IL1组相比，有明显的差异性(P＜005)。和IL1组相比，3组(对照组、IL1加NAME组、IL1+骨炎定方含药血清组)均明显增加了Ⅱ型胶原mRNA的表达，但各组间无差异(P＞005)。培养细胞上清液中亚硝酸盐含量测定显示：关节软骨细胞几乎不产生NO，但在IL1刺激下可产生NO，而加入NO合酶抑制剂NAME后，可部分抑制NO产生，骨炎定方含药血清组也显示出可以部分抑制NO的产生，其作用与NO合酶抑制剂NAME统计学处理没有明显差异。［结论］骨炎定方可以促进人软骨细胞增殖、能抑制iNOS的表达，增加Ⅱ型胶原的表达，这种作用与使用一氧化氮合酶抑制剂得出的结果没有明显差异，可能是中医药补肾益气行血法保护软骨细胞作用途径之一。
关键词：中医药；补肾益气行血法；骨炎定；软骨细胞；一氧化氮合酶；Ⅱ型胶原
Effect of Chinese Medicine gu yan ding on inhibition of AO chondrocyte secreting collagen type Ⅱ by nitrogen monoxidum
Abstract：［Objective］To observes the effect of Chinese medicine gu yan ding (GYD)on the inhibition of AO chondrocyte secreting collagen type Ⅱ by nitrogen monoxidum,and to study its protecting mechanism［Method］Chondrocytes were isolated from AO femoral head cartilage and divided into control group of pure blood serum,IL1 group,IL1+NAME group,GYD+IL1 groupGYD was added to subculture cells and its influence on chondroncyte proliferation in different time was examined by MTT method,and the influence on collagen type Ⅱ and iNOS (inducible nitrogen oxide synthase),and mRNA expression were also examined by RTPCR method［Result］GYD could proliferate chondrocyte in different stage,the iNOSmRNA expression was higher in the experimental groups than that in control groupThe expression was inhibited in IL1+NAME group and GYD+IL1 group,as compared with IL1 group with a significant difference (P＜005)The collagen type Ⅱ expression was higher in all three experiment groups than that in control group (P＞005)without significant differenceNitrite content test in supernatant appeared that chondrocyte almost did not secret NO,but secreted NO after IL1 stimulating,and secret was inhibited after adding NOS inhibitor without significant difference［Conclusion］GYD can stimulate proliferation of chondrocyte,inhibit iNOS,increase collage type Ⅱ,and iNOSIt plays a role in the mechanism of chondrocyte protection
Key words：Chinese medicine; Gu yan ding;Chondrocyte;iNOS;Collagen type Ⅱ
一氧化氮(NO)在骨关节炎和关节软骨代谢中具有重要的病理生理作用，研究表明软骨细胞是NO在关节中产生的最主要来源〔1〕。软骨细胞可以表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS，NOSⅡ)，并已经被克隆和识别〔2〕。本研究旨在探讨中医骨关节炎的常用治法―补肾益气活血法对NO的作用。
1 材料与方法
11 组织材料
髋关节炎患者行人工关节置换术时，取出的股骨头关节面软骨。
12 动 物
体重（250±20）g SD大鼠，共10只，雌雄各半，清洁级，日龄100~200 d，由广州中医药大学实验动物中心提供(质量合格证号粤检证号2003A028号)。
13 主要仪器和设备
CO2培养箱(美国SL)、倒置显微镜(Leica)、超净工作台(上海净化设备厂)、酶标仪(Barad 3300)、冷冻高速离心机(Hittech)MJ220(PCR仪)、GDS 8000凝胶成像系统。
14 主要试剂及药物
141 分离及培养细胞试剂
DMEM(Gibco)，L谷氨酰胺(华美生物工程公司)，HEPES、胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶、小牛血清(院上海细胞所)，链霉素、青霉素、EDTA(上海试剂一厂)。
142 检测试剂
MTT(华美生物工程公司)，RNA抽提试剂盒SK321(songon)，RTPCT试剂盒(大连宝泰克)，引物的合成(songon)Marker(晶美公司)，对氨基苯磺酰胺、萘基乙二胺(上海试剂一厂)、氮G-单甲基-左旋精氨酸(LNAME，songon)。
142 骨炎定方组成
由补骨脂、骨碎补、牛膝、红花等组成，属补肾益气行血治法的方剂，由广州中医药大学第一附属制剂科提供片剂，批号20031020。
15 含药血清的制备
骨炎定片，溶于生理盐水中，含量012 g／ml，治疗组每只大鼠5 ml／d，连续给药1个月，于末次给药后1 h采血，以3 000 r/min 离心20 min，取上清，抽滤除菌后分装，-20℃保存备用。
16 软骨细胞培养
参照〔3〕方法将髋关节骨关节炎行全髋关节置换时，取出股骨头，剔除附着的组织，DHanks液漂洗后，用解剖刀片削下关节软骨。DHanks液漂洗，Ⅱ型腔原酶消化，振荡，离心，弃上清，细胞经PBS洗后，加含有血清的培养液，将细胞悬液稀释成2×108／L～3×108／L密度接种于培养瓶，于37℃、饱和湿度、5％CO2条件下培养。72 h后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每2 d更换1次。
17 含药血清对软骨细胞的作用
参照〔3〕MTT法测软骨细胞方法将第2传代细胞接种在96孔板中，密度为2×104 个／cm2，分为4组：对照组、IL1组、IL1加NAME组、骨炎定方含药血清组，在24、48、72、96 h时段内，分别加入正常血清、IL1 100 μg／ml、IL1 100 μg／ml和NAME 1 mg／ml、IL1 100μg／ml加骨炎定血清刺激。隔天换液，第7 d加入50 mg／ml的MTT 120 μl／孔，孵育4 h后，吸去上清液，加DMSO 200 μl／孔，10 min后，待沉淀完全溶解后，用酶联免疫检测仪在590 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。细胞增殖率，细胞增殖率=［（590实验组-590对照组)／590对照组］×100％，并定义细胞增殖率为样品活力的衡量标准。
18 亚硝酸盐(NO)测定
据Griess氏反应法加以改进。在96孔酶标板内加入细胞培养上清液100 μl，再加入1%对氨基苯磺酰胺50 μl，4℃放置15 min，加入01%萘基乙二胺，室温30 min后置于酶标仪590 nm处读取OD值。以10~100 μm的亚硝酸盐溶液作为标准曲线。
19 iNOS及Ⅱ型胶原总RNA提取和半定量RTPCR
按每10cm2加入1 ml的TRIZOL于培养孔内，静置5 min，按TRIZOL 1 ml加入氯仿02 ml，于4℃，10 000 r／min离心15 min，倒去上清，75％乙醇清洗后通风橱干燥，加DEPC 50 μl水溶解。逆转录反应：混合RNA、dNTP和AMV等，逆转录后的cDNA置-20℃保存，在DNA扩增仪(MJ)上进行PCR扩增30个循环，退火温度为59℃，取PCR扩增产物5 μl在15％琼脂糖中电泳，GDS 8000凝胶成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件行灰度扫描分析，以目的基因与Marker中的最小片段条带灰度之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。各组间进行比较。聚合酶链反应引物设计：聚合酶链反应引物设计：iNOS为：5′-ACAAGCCTACCCCTCCAGAT3′，5′-CTCTATTTTTGCCTCTTTGA-3′。Ⅱ型胶原为：5′-TCACGTACACTGCCCTGAAG3′，5′-CTAGAGTGACTGAGATTGGA-3′。
110 统计学分析
数据用SPSS 100软件进行统计学分析，结果以(x-±s)表示，比较采用t检验。
2 结果
21 MTT法测软骨细胞增殖
对照组用空白血清刺激，骨炎定含药血清刺激，结果如表1所示，MTT法的结果显示：加入骨炎定含药血清后，有促进细胞增殖的作用。
表1说明，在24、48、72、96 h时段内，经统计分析，中药组与对照组、IL1组、IL1加NAME组相比较均有显著性差异(*P＜005)。表1 骨炎定方含药血清对软骨细胞增殖的影响(略）
22 培养细胞上清液中NO含量
正常的关节软骨细胞几乎不产生NO，但在IL1刺激下可产生大量NO，而加入NO合酶抑制剂NAME后，可部分抑制NO产生，中药组也有抑制NO的作用。经统计学分析，NO的分泌量，和对照组相比，IL1刺激后，NO的分泌量有显著增加(P＜001)（表2）。3、4组与单纯的IL1刺激相比，分泌NO的量有差异(P＜005)（图1、2）。表2 骨炎定方含药血清对软骨细胞一氧化氮合酶mRNA表达的影响(略)
23 培养细胞一氧化氮合酶mRNA表达
24 Ⅱ型胶原表达（表3）
3 讨论
NO在骨关节炎的发生、中所起的作用主要是通过它对软骨的影响实现的。NO已被证实能抑制蛋白聚糖的合成(通过抑制硫酸盐合成氨基葡萄糖)，这一过程能被一氧化氮合酶抑制剂缓解，有证据说明NO可以通过抑制IL1介导蛋白聚糖合成而实现上述作用〔4〕。Ⅱ型胶原是关节软骨的特征性成分，它的表达量减少是体外软骨细胞培养反分化时最重要的特征之一〔5〕；而在骨关节炎软骨退变、基质降解、失染的同时也有Ⅱ型胶原减少。姚力〔6〕等也发现骨关节炎软骨中Ⅱ型胶原免疫组化染色不均匀，骨关节软骨基质中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的破坏增强与软骨细胞对其合成增强同时存在。而NO对胶原尤其是Ⅱ型胶原的合成是具有强烈的抑制作用的，通过抑制脯氨酰羟化酶影响胶原的合成，使软骨的基质缺乏抗张能力而容易分解〔7〕，这是NO在骨关节炎进程中的重要一环。
本研究显示，骨炎定方具有促进体外人骨关节炎软骨细胞增殖的作用；能抑制炎性因子IL1诱导的一氧化氮合酶表达，其作用与一氧化氮合酶抑制剂NAME相当；并对抗NO的抑制软骨细胞Ⅱ型胶原的合成。
中医基础理论认为，《素问・六节脏象论篇》曰,“肾者，主蛰藏之本，精之处也，其华在发，其充在骨。”因此对骨病的应该从肾论治。因为“肾主骨，生髓”，肾虚则筋骨不荣。本实验所用的补肾益气活血方来源于陈基长教授的经验方――骨炎定方，以补益肝肾为主，兼以益气活血，达到攻补兼施，标本兼治的目的，临床上取得良好的疗效〔8〕。实验研究可以明显延缓兔实验性骨关节炎的关节软骨的病理变化，特别是对于软骨细胞的病理改变(软骨细胞丢失、软骨细胞的排列及细胞克隆)方面与对照组比较有显著的差异〔9〕。这些是采用骨炎定作为补肾益气活血治法所代表的理论依据。
本实验中，软骨细胞取材于髋关节晚期骨关节炎患者关节置换手术中切除的股骨头。骨关节炎软骨中的诱导型一氧化氮合酶(iNOS，NOSⅡ)水平是否上调取决于炎症早期的细胞刺激因子，人类的骨关节炎病程中的确存在炎症急性发作期，期间iNOS被猜想应该是含量上升的，但是由于其表达的难以预测，iNOS的检测难以进行，有些作者认为晚期骨关节炎中，软骨细胞对iNOS的刺激生成的因子反应不灵敏，但是从本实验结果来看，骨关节炎软骨细胞体外在IL1刺激下能够继续表达iNOS，使NO的含量明显增加，如果加入骨炎定含药血清，则NO的含量明显减少，与一氧化氮合酶抑制剂NAME的作用相仿，而且没有显著差异，这说明骨炎定方能抑制体外人骨关节炎软骨细胞产生NO。
Ⅱ型胶原的表达检测结果显示，体外的人骨关节炎软骨细胞传代后能继续表达Ⅱ型胶原，加入IL1的刺激后，Ⅱ型胶原的表达明显减少，而一氧化氮合酶抑制剂NAME和骨炎定含药血清都能对抗IL1这种抑制Ⅱ型胶原表达的现象，且没有显著差异，结合NO含量检测的实验内容，本实验证实了：(1)NO可抑制软骨细胞Ⅱ型胶原的合成。(2)NO对Ⅱ型胶原的抑制作用是通过减少Ⅱ型胶原mRNA表达量完成的。(3)IL1对于关节软骨中Ⅱ型胶原的抑制作用至少部分是由NO介导的。(4)骨炎定方对体外人软骨细胞在IL1刺激下产生NO和抑制Ⅱ型胶原表达有拮抗作用。
目前一氧化氮合酶抑制剂治疗骨关节炎是一个热门的研究方向，从众多相关研究结果看来，一氧化氮合酶抑制剂如氮G-单甲基-左旋精氨酸(LNAME)等在抑制iNOS表达的同时可以观察到Ⅱ型胶原表达的增加，这与本实验结果是一致的，而且，加入骨炎定含药血清后软骨细胞的增殖情况明显好于空白组，提示中医药治疗骨关节炎的良好疗效很有可能是通过抑制iNOS表达、保护Ⅱ型胶原，同时促进软骨细胞增殖的途径来达到的，但是其中的机理仍有待进一步的研究。
文献：
〔1〕Grabowski PS,Macpherson H,Ralston SH,et al.Nitric oxide production in cells derived from the human joint［J］.Br J Rheumatol,1996,35(3):207.
〔2〕Maier R,Bilbe G,Rediskc J,et al.Inducible nitric oxide synthase from human articular chondrocytes:cDNA cloning and analysis of mRNA expression［J］.Biochim Biophys Acta,1994,1208(1):145150.
〔3〕鄂征.组织培养和分子细胞学技术［M］.北京：人民卫生出版社，1997,84.
〔4〕Taskiran D,StefanovicRacic M,Georgescu H,et al.Nitric oxide mediates suppression of cartilage prolteoglycan synthesis by interleukin1［J］.Biochem Biophys Res Comms,1994，200(1)：142148.
〔5〕曲绵域.软骨细胞培养过程中细胞反分化的研究［J］.北京医科大学学报,1992，24(2)：330.
〔6〕姚力，周乙雄，赵丹惠,等.骨关节炎软骨中Ⅰ型和Ⅱ型胶原的分布［J］.矫形外科杂志,2002，9(2)：167169.
〔7〕Cao M,Georgescu HI,Evans CH.Inhibition of prolyl hydroxylase by nitric oxide.Trans Orthop［J］.Res Soc,1997,22:411.
〔8〕骨炎定治疗膝骨关节炎30例――附醋氨酚治疗30例对照［J］.浙江中医杂志,2003，38(10)：430.
〔9〕唐勇.骨炎定对兔实验性膝骨关节炎关节软骨的组织病影响［J］.四川中医，2004，22(1)：23.
