氯沙坦及A779对糖尿病心肌病大鼠心肌间质纤维化的影响

【摘要】  目的 观察氯沙坦对糖尿病心肌病大鼠心肌间质纤维化的影响并探讨其机制。方法 将39只雄性Wistar大鼠给予链脲佐菌素（STZ）55?mg/kg一次性腹腔注射12周后，将血糖＞16.7?mol/L且具有多饮、多食、多尿现象的36只大鼠纳入实验。实验大鼠随机分为糖尿病心肌病 (DCM)组、氯沙坦组和A779+氯沙坦组，每组12只。给予氯沙坦组大鼠氯沙坦10?mg/(kg·d)灌胃，给予A779+氯沙坦组大鼠氯沙坦10?mg/(kg·d)灌胃和血管紧张素?（1?7）受体拮抗剂A779 100?ng/(kg·d)尾静脉注射，给予DCM组大鼠等量生理盐水灌胃，持续4周。第16周末采用心脏超声、Masson染色及RT?PCR的方法测定大鼠的左室舒张末期内径（LVIDd）、左室收缩末期内径（LVIDs）、短轴缩短率（FS）、左室射血分数（LVEF）、E/A（E峰/A峰）、左室心肌胶原含量、ACE2 mRNA的表达。结果 与DCM组比较，氯沙坦组和A779+氯沙坦组大鼠的LVIDs、LVIDd降低（P＜0.01），E/A、FS、LVEF升高（P＜0.01），左室胶原含量减轻（P＜0.01），ACE2 mRNA表达增高（P＜0.01）；与氯沙坦组比较，A779+氯沙坦组大鼠LVIDs、LVIDd升高（P＜0.05），E/A、FS、LVEF降低（P＜0.05），左室胶原含量升高（P＜0.05），ACE2 mRNA表达无明显差异。结论 氯沙坦通过Ang?(1?7)途径减少纤维化及改善心功能。

【关键词】  氯沙坦；血管紧张素?(1?7)；血管紧张素转换酶?2；A779；糖尿病；心肌病；大鼠，Wistar

　
　　To investigate the effect of Losartan and A779 on myocardial interstitial fibrosis in diabetic cardiomyopathy (DCM). Methods  Thirty?nine male Wistar rats were intraperitoneally injected with streptozocin (STZ) to induce hyperglycemia. After 12 weeks of the STZ injection, rats whose blood glucose was higher than 16.7?mmol/L and who had polydipsia, hyperphagia and polyuria were randomly divided into 3 groups: the DCM group, the Losartan group and the A779+Losartan group. The DCM group was subjected to perfusion of normal saline into the stomach once daily, the Losartan group perfusion of Losartan once daily, and the A779+Losartan group perfusion of Losartan and injection of A779 through the tail vein once daily. At the end of the experiment, LVIDs, LVIDd, E/A, LVEF and FS were determined by ultrasound. Then the collagen level was determined by Masson staining, and the mRNA expression of the angiotensin?conversion enzyme 2 (ACE2) was determined by real?time RT?PCR. Results  By the end of the experiment, the LVIDs, LVIDd and the collagen level of the Losartan group and the A779+Losartan group were lower than those of the DCM group (P＜0.01),  also the E/A, FS, LVEF levels and the expression of ACE2 mRNA of the Losartan group and the A779+Losartan group were higher than those of the DCM group(P＜0.01). The LVIDs, LVIDd and collagen content of the A779+Losartan group were higher than those of  the Losartan group(P＜0.05), and   
E/A, FS and LVEF of the A779+Losartan group were lower than those of the Losartan group(P＜0.05). However the expression of ACE2 mRNA had no difference between the Losartan group and the A779+Losartan group. Conclusions  Losartan ameliorates the myocardial interstitial fibrosis via Ang?(1?7).

　　Key words： Losartan； Angiotensin?(1?7)； Angiotensin?convertion enzyme?2； A779； Diabetes mellitus； Cardiomyopathy； Rats， Wistar  

　　糖尿病心肌病（DCM）为糖尿病的并发症，其发病机制与肾素-血管紧张素系统(rennin?angiotensin system，RAS)的激活［1］、葡萄糖代谢障碍、细胞内钙超载［2］、氧自由基清除障碍以及心肌间质纤维化等有关，其中RAS的激活与DCM及心衰的发生密切相关。血管紧张素2（ACE2）是近年发现的人类首个ACE同系物［3?4］，能够通过水解AngⅠ或Ang Ⅱ生成血管紧张素?（1?7）［Ang?(1?7)］。Ang?(1?7)具有舒张血管、利钠利尿、抗生长和抗增殖的作用，而Ang?(1?7)受体拮抗剂A779能够拮抗其大部分的作用［5］。Ferrario等［6］2608的研究证实，血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂氯沙坦能够升高ACE2和Ang?（1?7），因此Ang?（1?7）可能是氯沙坦改善心功能的机制之一。本研究制备了DCM模型，旨在观察氯沙坦及A779对其心肌间质纤维化以及心功能的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验分组

　　雄性Wistar大鼠39只，购自山东大学实验动物中心，体重150～200?g，室温饲养，标准饲料，参照张春虹等［7］的方法，动物禁食12?h后将链脲佐菌素(STZ)按55?mg/kg一次性腹腔注射制作糖尿病模型。大鼠继续喂养至12周后，将血糖＞16.7?mol/L且具有多饮、多食、多尿现象的36只大鼠纳入实验。实验大鼠随机分为糖尿病心肌病（DCM）组、氯沙坦组和A779+氯沙坦组，每组12只。给予氯沙坦组大鼠氯沙坦钾10?mg/(kg·d)灌胃，给予A779+氯沙坦组大鼠氯沙坦钾10?mg/(kg·d)灌胃和A779 100?ng/(kg·d)尾静脉注射，给予DCM组大鼠等量生理盐水灌胃。各组大鼠继续给予原饲料喂养至16周。氯沙坦钾由杭州默沙东制药有限公司惠赠，A779购自上海生物化学公司。

　　1.2  心功能测定

　　实验末用3％戊巴比妥钠按1?mL/kg?将大鼠麻醉成功后固定在手术台上，使用Philips 7500数字化超声心动图仪(探头频率10～12?MHz)，测定心功能。应用M型超声和二维超声测定左室舒张末期内径（LVIDd）、左室收缩末期内径（LVIDs）、并短轴缩短率（FS）及左室射血分数（LVEF），应用脉冲多普勒法测定E峰和A峰并计算E/A比值，然后迅速打开胸腔，留取心尖部置于液氮中保存备用，其余部分置于4%多聚甲醛中固定备用。

　　1.3  病检测

　　常规石蜡切片脱蜡后行Masson染色，光镜下观察心肌细胞呈红色或黄色，胶原纤维呈蓝绿色，红细胞呈橘红色，最后通过图像分析系统计算心肌组织中胶原的含量。

　　1.4  ACE2 mRNA的检测

　　采用RT?PCR方法。取约100?mg大鼠心脏组织剪碎，加入1?mL Trizol并用匀浆器磨碎组织，按说明书操作一步法提取总RNA，取5?μg?总RNA按逆转录试剂盒说明合成cDNA第一链。取定量cDNA模板(2?μL)加入靶基因ACE2的上下游引物，20?μL体系行PCR反应。ACE2上游引物序列为: 5′?CGTATGGGTGAGTGATTTG?3′,下游引物序列为：5′?AGGAGGCTCGTAAGGTG ?3′， PCR产物208?bp；β?actin上游引物序列为：5′?ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG?3′， 下游引物序列为: 5′?ATGATGGAG TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT?3′，PCR产物360?bp。扩增条件为：预变性95?℃×3?min；变性 95?℃×30?s，退火56?℃×30?s，延伸 72?℃×1?min；40个循环后再延伸5?min。取10?μL DNA扩增产物，在含0.5?μg/mL溴己啶、1.5％的琼脂糖凝胶板上电泳25?min，以β?actin为内参照对RT?PCR结果进行分析。上述引物由上海博亚生物工程技术公司合成。

　　1.5  统计学处理

　　所有结果以±s表示，实验数据用SPSS15.0 for windows统计软件进行统计分析，多组间的均数比较使用方差分析，组间比较使用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2  结  果

　　2.1  一般情况

　　实验过程中有3只大鼠血糖升高未达到成模标准。6只大鼠死亡，其中DCM组2只，氯沙坦组1只，A779+氯沙坦组3只，死亡原因可能为感染、糖尿病酮症酸中毒或其他糖尿病并发症，共有30只大鼠完成实验。

　　2.2  心功能检查结果

　　与DCM组比较，氯沙坦组和A779+氯沙坦组大鼠的LVIDs、LVIDd降低，E/A、FS、LVEF升高（P＜0.01）；与氯沙坦组比较，A779+氯沙坦组大鼠的LVIDs、LVIDd升高，E/A、FS、LVEF降低（P＜0.05），见表1（略）。

　　氯沙坦组左室心肌胶原含量(14±3)%和A779+氯沙坦组(17±3)%较DCM组(22±3)%明显降低（P＜0.01）；而A779+氯沙坦组左室胶原含量则较氯沙坦组升高（P＜0.05），见图1。

　　2.4  心脏ACE2 mRNA的表达结果
 
　　RT?PCR显示，氯沙坦组光密度比值（0.68±0.05）和A779+氯沙坦组光密度比值（0.63±0.03）均较DCM组（0.38±0.09）明显上调（P＜0.01），但氯沙坦组和A779+氯沙坦组之间无明显差异，见图2。

　　3  讨  论

    DCM是以心肌细胞肥大、 间质纤维化和血管壁增厚为主要特征的一种特异性心肌病。目前认为，RAS激活在DCM的发病机制中具有重要作用。糖尿病时，心肌局部的RAS系统被激活，升高的AngⅡ可直接作用于心肌成纤维细胞，通过细胞表面的AT1受体刺激心肌成纤维细胞增生及胶原代谢的改变,引起心肌间质的重建，促进心肌间质的纤维化［8］。本研究通过建立DCM模型研究氯沙坦及A779对其心肌间质纤维化、心功能以及ACE2表达的影响,并探讨了氯沙坦对其影响的机制。结果显示，氯沙坦可以使心脏ACE2表达明显升高，左室胶原含量明显降低，心功能明显改善；给予Ang?(1?7)受体拮抗剂A779后，大鼠左室胶原含量升高，心功能降低，提示Ang?(1?7)参与了氯沙坦改善心肌间质纤维化的过程。

    糖尿病心肌病时，心肌组织主要表现为心肌间质及血管周围纤维化，胶原含量增多和排列紊乱，造成左室心肌僵硬而影响舒张功能。Ang?(1?7)是近年发现的RAS新成员。目前研究认为，Ang?(1?7)具有舒张血管、利钠利尿、抗生长和抗增殖的作用，被认为是对抗Ang Ⅱ作用最强的舒血管活性物质之一［9］。齐峰等［10］采用Ang?(1?7)作用于培养的心肌成纤维细胞发现，Ang?(1?7)可以浓度依赖性的抑制Ang Ⅱ浓度增加引起的心肌成纤维细胞增值以及胶原的合成。Tallant等［11］研究发现，Ang?(1?7)可以通过激活mas受体［（mas为Ang?(1?7)特异性受体）］降低MAPK/ERK信号转导通路的活性，而MAPK/ERK信号转导通路是最为普遍的促进细胞增殖和分化的信号途径，能被多种生长因子、 细胞因子及促分裂剂激活。相关研究也同时表明［12?14］，在大鼠和人类心肌梗死后，心肌ACE2和Ang?(1?7)水平均增加，通过输注Ang?(1?7)可以改善心梗后大鼠的心功能并延缓心衰的进展。Bayorh等［15］采用Ang?(1?7)和其拮抗剂A779干预自发性高血压大鼠后发现，Ang?(1?7)能够降低平均动脉压、升高前列环素和一氧化氮，并降低血栓烷素A2的水平，而A779可以减弱Ang?(1?7)的上述作用。本研究结果表明，氯沙坦组和A779+氯沙坦组大鼠ACE2 mRNA的表达均增高，与报道一致［6］2608，但两组ACE2 mRNA的表达没有差异。目前对氯沙坦升高ACE2表达的具体机制仍然不清楚，其原因可能是AT1受体被阻断后，可通过负反馈机制使ACE2 mRNA表达增加［16］。另有研究证实［17］当AT1受体被阻断后，ACE2在心肌AngⅡ向Ang?(1?7)转化的过程中起到重要的作用并具特异性，当应用选择性的ACE2阻滞剂MLN?4760后这一作用被阻断。

    总之，通过采用氯沙坦及A779单用和联合干预DCM大鼠模型表明，Ang?(1?7)是氯沙坦抗心肌间质纤维化及改善心功能的重要机制之一，这为糖尿病心肌病的防治及研制改善心功能的药物提供了新的思路。

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