bFGF对关节软骨缺损的修复作用

                作者：司全明 侯筱魁 毛宾尧

【摘要】  目的 观察碱性成纤维细胞生长因子对关节软骨缺损修复的影响。方法 在兔双侧股骨髁间窝造成骨软骨缺损，一侧应用碱性成纤维细胞生长因子，另一侧作对照。术后3个月，利用组织切片及扫描电镜等方法，观察两侧骨软骨缺损修复情况。结果 修复3个月后，对照侧软骨缺损难以完全修复，修复细胞形态多样，似成纤维细胞，蛋白多糖颗粒较少。应用碱性成纤维细胞生长因子侧软骨缺损基本修复，修复细胞似软骨细胞，有较多的蛋白多糖颗粒与胶原纤维结合。缺损修复组织评分，碱性成纤维细胞生长因子组优于对照组。结论 碱性成纤维细胞生长因子可促进骨软骨缺损的修复。

【关键词】  碱性成纤维细胞生长因子 软骨缺损 修复

　　Effects of bFGF on Articular Cartilage Defect

      Abstract：Objective  To explore the effect of basic fibroblast growth factor(bFGF) on the repair of articular cartilage defect.Methods  Cartilage defects in intercondylar fossa of the femur were created in rabbit bilateral knees.One side was treated by bFGF，the other side was used as contrast.Afer 3 months following operation，the methods，such as transmission electron microscopy(TEM)，scanning electronic microscopy(SEM) were applied to the observation of cartilage repair.Results  Cartilage defect was difficult to repair in the contrast.The cells is similar to fibrolblast cells.The amount of proteoglycan was less than that in the bFGF groups.In the bFGF group，the cartilage defect can be repaired.The cells were similar to chondrocytes.The total scores on the histological grading scale were significantly better the defects treated with bFGF than that for the contrast defects.Conclusion  bFGF may be could improve the repair of cartilage defect.

    Key words：bFGF；cartilage defect；repair

    随着高能、高速创伤的不断增多及人口老龄化的进程，关节软骨缺损疾患不断增加。由于关节软骨缺乏直接的血液供应、淋巴循环和神经支配，并具有低代谢的生理特点，关节软骨缺损后的自行修复能力非常有限。关节软骨缺损的修复已成为临床骨科急需解决的问题之一。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibrolast growth factor，bFGF)可促进间充质干细胞增殖、分化，增加修复细胞的数量。为此，观察bFGF对关节软骨缺损修复的影响，防止膝关节软骨损伤进行了实验研究。

　　1  材料及方法

　　1.1  标本的获取 

　　取新西兰大白兔12只，体重3.0～3.5 kg，雌雄不限。将每只兔的双侧膝关节随机分为bFGF组和对照组。25 g/L戊巴比妥钠1.0 mL/kg耳缘静脉注射麻醉。麻醉后，兔仰卧位，膝关节屈曲，小腿固定在自制的固定架上。双侧膝关节前方剪毛，常规消毒、铺巾。取髌韧带内侧切口，显露股骨髁间窝。在股骨髁间窝造成表面为4 mm×3 mm的骨软骨缺损。用0.25％氯霉素及生理盐水冲洗后，在bFGF组骨软骨缺损部，放入浸有bFGF(1 μg的bFGF溶于1 mL％透明质酸钠，Sigma公司)的明胶海绵一块，约4.5 mm×3.5 mm大小。对照组缺损部放同样大小仅浸有1％透明质酸钠的明胶海绵一块，无bFGF，缝合切口。术前1 h及术后3 d，肌注青霉素80万单位。动物放于笼中常规饲养，于术后4 d和8 d膝关节分别再注射一次，bFGF组注射1 μgbFGF(1 μg的bFGF溶于1 mL 1％透明质酸钠)，对照组膝关节注射透明质酸钠1 mL。术后3个月经耳缘静脉注射空气处死动物。取股骨髁标本进行扫描电镜及组织切片行形态学等观察。

　　1.2  组织切片光镜观察 

　　bFGF组和对照组分别取8个标本，标本经磷酸缓冲液清洁，用40 g/L的多聚甲醛PBS固定48 h。修整标本后，在100 g/L的乙二胺四乙酸中脱钙。每周换液一次，利用针刺法确定脱钙情况，6～7周脱钙彻底后，于软骨缺损中部横行切断，每一标本分为2部分，一部分用于组织切片光镜观察，一部分用于扫描电镜观察。组织切片观察标本经流水冲洗后，乙醇逐级脱水透明，石蜡包埋，连续5 μm切片，常规HE染色，OlympusBH?2显微镜下观察，并进行组织学评分。

　　1.3  扫描电镜观察 

　　扫描电镜，标本置2％戊二醛磷酸缓冲液中固定24 h(4℃)，用10 g/L四氧化锇固定2 h，乙醇逐级脱水，临界点干燥后，黏附于载物台上，真空喷金，环境扫描电镜(XL30，ESEM)观察关节表面的情况。

　　1.4  透射电镜观察 

　　bFGF组和对照组分别取4个标本，于软骨缺损局部取修复组织，软骨修复组织放入2％戊二醛磷酸缓冲液中(含0.2％钌红)，置4℃冰箱中固定48 h。将标本修整为宽约1.0 mm的长条形，PBS漂洗；1％的四氧化锇固定2 h，再PBS漂洗；乙醇逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片；醋酸双氧铀与柠檬酸铅双重染色；Hitachi?600透射电镜观察软骨修复细胞及胶原纤维上蛋白多糖颗粒的变化。

　　2  结 果

　　2.1  光镜观察 

　　对照组缺损局部只有部分修复组织，关节面不平整，修复细胞排列紊乱(见图1)。bFGF组修复软骨组织与周围软骨平齐，关节表面较平整，修复细胞密度较高，排列较为杂乱(见图2)。

    利用Sellers等［1］对骨软骨缺损修复组织的评分标准进行评定，Sellers对骨软骨修复组织的评分标准包括缺损的修复程度、修复细胞形态、修复组织与临近软骨组织的整合、修复组织表面情况，软骨下骨形成情况及潮标形成情况等8方图2  术后3个月，bFGF组关节软骨缺损能修复，关节面基本平整(HE，×100)面，最低0分，最高31分。分数越低，表明修复组织质量越好。应用bFGF侧为10.7±3.6，未用bFGF侧为18.4±4.1，两组间t检验P＜0.05，表明bFGF组优于对照组。

　　2.2  透射电镜观察 

　　对照组修复细胞形态多样，似成纤维细胞，胶原纤维上蛋白多糖颗粒较少(见图3)。bFGF组修复细胞似软骨细胞，有较多的蛋白多糖颗粒与胶原纤维结合(见图4)。

　　2.3  扫描电镜观察 

　　对照组关节面不平整，修复组织表面粗糙，与邻近关节软骨之间有裂隙存在，软骨下骨与周围的软骨下骨尚未平齐。实验组软骨下骨与邻近的软骨下骨基本平齐，关节表面较为平整，修复组织与邻近关节软骨间有裂隙存在。

　　3  讨 论

    较小的骨软骨缺损可以修复，较大的骨软骨缺损难以修复，原因之一可能是局部缺乏足够的修复细胞数量及软骨细胞分化不足［2］。目前，增加局部修复细胞数量的方法主要有两种：a)利用组织工程的方法，将软骨细胞或骨髓中的间充质干细胞等分离培养，增殖后移植到软骨缺损的部位，直接增加局部的修复细胞数量；b)利用骨膜、软骨膜移植或局部应用生长因子，通过促进局部细胞的分裂增殖，增加局部的修复细胞数量。在生长因子中，bFGF、转移生长因子?β(TGF?β)、骨形成蛋白?2(BMP?2)等多种生长因子均可促进细胞的增殖分裂。体外研究表明，bFGF是最强的促细胞有丝分裂剂，它可促进软骨细胞增殖13.5倍［3］。有研究表明，TGF?β1、BMP?2可促进软骨基质的钙化，导致滑膜增生，出现关节软骨坏死等病理变化。故我们选用bFGF。结果与Cuevas等［4］观察到的bFGF促进较大范围软骨缺损的修复情况相似，修复组织为类透明软骨，无明显滑膜增生及软骨坏死。

    生长因子为蛋白质，在体内可被降解，其在生物体内的半衰期较短，如TGF?β的半衰期不超过1 h。利用同位素标记的bFGF在关节内也只能维持几小时［5］，其生物半衰期不超过6 h。为充分发挥生长因子在体内的作用，需延长生长因子的作用时间。主要有以下三种方法：a)利用微泵持续局部给药，维持局部有效的药物浓度；b)采用多次反复注射的方法；c)将生长因子与载体结合，让生长因子缓慢缓放。所用载体有胶原、透明质酸钠、明胶海绵等［6～7］。实验研究表明，用透明质酸钠作为bFGF的载体，可减少bFGF用量，延长其生物学作用时间。我们将生长因子溶于透明质酸钠中并用明胶海绵作为载体，希望起到缓释的作用。

    在骨软骨缺损的修复过程中，2周内是间充质干细胞增生的主要阶段。当局部有足够数量的间充质干细胞后，在关节内低氧张力、高应力的环境下，会促使间充质干细胞分化为软骨细胞。同时bFGF促进细胞增殖的作用与局部细胞数量密切相关，在低密度时促进细胞增殖，在高密度时促进细胞增殖作用不明显。我们注射用三次就是希望bFGF在细胞增生阶段发挥最大作用。

    关于生长因子的用量，在体外软骨细胞培养中，不同的剂量有不同的作用。bFGF、TGF?β在高低不同的浓度下，可起相反的作用［8］。在体内当bFGF用量较大时，也会影响正常软骨细胞的增殖。在体内修复软骨缺损，bFGF的最适用量尚不清楚，我们参照Andreshak等在体内应用bFGF的用量。

    应用bFGF后的软骨修复组织与正常关节软骨有别，间充质干细胞向软骨细胞定向分化是由多种因子调节的结果。多种因子的联合应用及在不同的阶段用不同的生长因子，促进修复细胞的增殖、分化，可能会进一步提高组织修复的质量。

【】
  　　［1］Sellers RS，Peluso D，Morris EA，et al.The effect of recombinant human bone morphogenetic protein?2(rhBMP?2) on the healing of full?thickness defects of articular cartilage［J］.J Bone joint Surg(Am)，1997，79(10)：1452?1463.

　　［2］Metsaranta M，Kujala UM，Pelliniemi L，et al.Evidence for insufficient chondrocytic differentiation during repaire of full?thickness defects of articular cartilage［J］.Matrix Biol，1996，15(1)：39?47.

　　［3］Stevens P，Shatzen EM.Synergism of basic fibroblast growth factor and interleukin?1 beta to induce articular cartilage?degradation in the rabbit［J］.Agents Actions，1991，34(1?2)：217?219.

　　［4］Cuevas P，Burgos J，Baird A.Basic fibroblast growth factor(FGF) promotes cartilage repair in vivo［J］.Biochem Biophys Res Commun，1988，156(2)：611?618.

　　［5］Shida JI，Jingushi S，Izumi T，et al.Basic fibroblast growth factor stimulates articular cartilage enlargement in young rats in vivo［J］.J Orthop Res，1996，14(2)：265?272.

　　［6］Andreshak JL，Rabin SI，Pptwardhan AG，et al.Tibial segmental defe ctrepair：chondrogenesis and biomechanical strength modulated by basic fibroblast growth factor［J］.Anat Rec，1997，248(2)：198?204.

　　［7］Fujisato T，Sajiki T，Liu Q，et al.Effect of basic fibroblast growth factor on cartilage regeneration in chondrocyte?seeded collagen sponge scaffold［J］.Biomaterials，1996，17(2)：155?162.

　　［8］Sah RL，Chen AC，Grodzinsky AJ，et al.Differential effects of bFGF and IGF?1 on matrix metabolism in calf and adult bovine cartilage explants［J］.Arch Biochem Biophys，1994，308(1)：137?147