Ⅳ型胶原在贲门癌自体荧光诊断中的意义初步探讨

            作者：陈胜林，李威△，曾永明，陈君填，郭毓文，李欣欣

【摘要】  目的  通过比较胃底贲门正常组织和癌组织中Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白分布差异，分析胃底贲门组织癌变后Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白分布的改变对组织的自体荧光产生的影响。方法  采用免疫组化技术,半定量计分分析Ⅲ、Ⅳ型胶原在16例贲门癌病人正常组织和癌组织中的分布差异。结果  正常组织的基底膜呈现很强的Ⅳ型胶原抗体阳性反应,在基底膜形成较粗的环形染色带；Ⅲ型胶原抗体阳性反应在细胞外间质呈连续的细丝纤维样。癌组织Ⅳ型胶原抗体反应在癌巢周边为阴性,或仅在残存的基底膜有片断的阳性反应；而Ⅲ型胶原在癌间质中的抗体阳性反应较正常组织变化不明显,或还稍有增强；Ⅲ型和Ⅳ型在正常组织和癌组织中的分布差异有极其显著性(P＜0.001)。结论  胃底贲门组织癌变后,细胞外基质内Ⅳ型胶原显著减少，而Ⅲ型胶原减少不明显；Ⅳ型胶原是胃底贲门黏膜细胞外基质自体荧光的主要来源；组织发生癌变后，细胞外基质中Ⅳ型胶原的降解是癌组织自体荧光减弱的主要原因之一。

　　【关键词】  自体荧光；贲门癌；Ⅲ、Ⅳ型胶原；荧光物质
  
　　Significance of the collagen type Ⅳ in auto-fluorescence diagnosis of cardiac cancer

　　【Abstract】  Objective  To compare the distribution of collagen typeⅢ and Ⅳ in mucosa of normal and carcinoma cardiac tissues and to analyze the influence of changed collagen on auto-fluorescence after canceration.Methods  Using immunohistochemical technique with monoclonal anti-collagen typeⅢ and Ⅳ, difference in distribution in extracellular matrix of two types collagen between normal and carcinoma tissues from 16 patients were measured with semi-quantitative score methods.Results  In normal mucosa, the epithelial basement membrane showed an intense positive reaction for monoclonal anti-collagenⅣ and an intensively stained ring band was formed around the grand basement membrane；collagen typeⅢ formed ring-like structures apparently representative of fibriform collagen immediately adjacent to the epithelial basement membrane. In carcinomatous mucosa, immunoreaction of the carinomatous cell nest was negative, or only remnants of positively were seen at the site of the former membrane by collagen type Ⅳ. The change of collagen typeⅢ was not apparent, or positives reaction in carcinomatous stroma was more intensity than in normal stroma. There were significant differences in distribution of collagen typeⅢ and Ⅳbetween normal and carcinomatous tissues(P＜0.001).Conclusion  After cardiac cancer occurring, collagen type Ⅳ in basement membrane and stroma decreased significantly, but collagen typeⅢ remained unchanged.The main collagen located in basement membrane was collagen type Ⅳand it was the main source of laser-induced auto-fluorescence in cardiac cancer basement membrane. After cancer occurring,the degradation of collagen type Ⅳ in basement membrane and stroma was the main causes of reduced intensity of laser-induced auto-fluorescence in carcinomatous tissues.

　　【Key words】  auto-fluorescence;cardiac neoplasm;collagen typeⅢ and Ⅳ;fluorescence substance

　　近年来,应用激光诱发荧光(LIF)光谱技术早期筛查与诊断消化道肿瘤的研究取得较大进展,研究证明正常组织和癌组织的自体荧光光谱存在差异,正常组织的自体荧光强度明显高于癌组织［1，2］。大量的显微自体荧光图像和荧光光谱的研究报道［3～6］认为，胃肠道的正常组织的荧光主要来源于细胞外基质和黏膜下层的胶原。那么癌组织与正常组织荧光光谱的差异是否和胃底黏膜细胞外基质中胶原的分布有关；组织发生癌变后,组织中胶原的分布是否也会发生改变；这种改变是否与贲门组织自体荧光的改变有关,值得进一步研究。笔者对胃底贲门组织细胞外基质中主要成分Ⅲ、Ⅳ型胶原在贲门正常组织和癌变组织中的分布进行了研究，现介绍如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  资料来源  标本取自我院普外科自2003年9～12月胃底贲门癌根治术切除的贲门组织,共16例，其中男10例,女6例,年龄26～79岁(中位年龄59岁)；病理组织分型：高分化腺癌6例,高分化黏液腺癌2例,中分化腺癌4例,低分化腺癌2例,低分化黏液腺癌2例。

　　1.2  标本制备  胃底贲门癌标本取自肉眼观坏死组织较少、黏膜尚完整的癌块；正常组织标本取自距癌块5cm以上的同一胃底贲门组织,其切缘均经病理切片证实未发现癌细胞,即癌组织样本数和正常组织样本数各为16例。手术后收集标本，冲去黏液、污物,用干试纸拭除水渍,置液氮罐中保存；实验时,将标本用冰冻切片机连续切片，制作为厚5μｍ切片,然后用多聚甲醛固定，分别行ＨＥ染色、免疫组化染色和对照染色。

　　1.3  实验方法  采用特异性和灵敏性高的链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法（SABC法）对Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白在胃底贲门正常组织和癌变组织中的分布进行自身对照检测，然后采用半定量计分法分析Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白在16例贲门癌病人正常和癌组织中的分布差异。

　　1.4  实验试剂  一抗：Ⅲ、Ⅳ型胶原单克隆抗体,效价1∶100；SABC试剂盒：含正常山羊血清；二抗生物素化山羊抗兔IgG；三抗链霉素抗生物素化过氧化物酶；DAB试剂盒。以上试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.5  实验流程  （1）用30% H2O2 1份+蒸馏水10份混合配成3% H2O2，室温5～10min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。（2）滴加5% BSA封闭液，37℃ 30min。甩去多余液体，不洗。（3）滴加适当稀释的一抗（浓度为1∶100），4℃过夜或37℃下孵育4h。0.02M PBS（pH 7.2～7.6）洗2min×3次。（4）滴加生物素小鼠抗人IgG 37℃ 30～45min。0.02M PBS（pH 7.2～7.6）洗2min×3次。（5）滴加试剂SABC，37℃ 30min。0.02M PBS（pH 7.2～7.6）洗5min×4次。（6）DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～30min。蒸馏水洗涤。（7）苏木素轻度复染。脱水、透明、封片。显微镜观察。

　　1.6  抗体阳性反应半定量计分方法  Ⅲ、Ⅳ型胶原抗体阳性反应半定量计分法：1分:基底膜抗体阳性反应很弱或无反应；2分：25%～75%腺体的基底膜出现抗体阳性反应,但呈间断性；3分:75%～100%腺体的基底膜出现连续性抗体阳性反应。

　　1.7  统计学方法  建立胃底贲门组织Ⅲ、Ⅳ型胶原抗体阳性反应计分分类的分布表,对Ⅲ、Ⅳ型胶原在正常、癌组织中分布差异的比较采用统计软件SPSS11.0进行秩和检验(Kruskal-Wallis test)。

　　2  结果与分析

　　2.1  贲门正常组织中Ⅲ、Ⅳ型胶原分布特点  正常组织细胞外基质中，特别是基底膜呈现很强的Ⅳ型胶原抗体阳性反应,在基底膜形成较粗的环形染色带；而Ⅲ型胶原抗体阳性反应在细胞外间质呈连续的细丝纤维样（见图1、图2）。

　　图1  Ⅲ型胶原在正常组织中的表达（略）

　　图2  Ⅳ型胶原在正常组织中的表达（略）

　　2.2  贲门癌组织中Ⅲ、Ⅳ型胶原分布特点  癌组织Ⅳ型胶原抗体反应在癌巢周边为阴性,或仅在残存的基底膜有片断的阳性反应；而Ⅲ型胶原在癌间质中的抗体阳性反应较正常组织变化不明显,或还稍有增强（见图3、图4）。

　　图3  Ⅲ型胶原在癌变组织中的表达（略）

　　图4  Ⅳ型胶原在癌变组织中的表达（略）

　　2.3  Ⅲ、Ⅳ型胶原分别在正常和癌组织构成分布的抗体阳性反应半定量计分比较  见表1。

　　表1  Ⅲ、Ⅳ型胶原分别在正常和癌组织构成分布的抗体阳性反应半定量计分比较  （略）

　　3  讨论

　　早在20世纪60年代初,生物学家在研究蛋白质、核酸、游离核苷酸等细胞大分子物质的荧光时,发现一定的荧光光谱与某些特定的分子结构相关。近几年Bottirol G等［1,7～9］研究认为,生物组织自体荧光的差别源于组织内荧光物质成分和形态分布的不同；生物组织内具有能发射特征峰的大分子,当正常组织发生癌变时,该荧光分子的性质或浓度发生改变,使其在正常组织和癌变组织自体荧光产生过程中的贡献大小不同,从而导致荧光光谱形态的改变,这是自体荧光光谱分析能辨别正常组织和癌变组织的基础。分析正常组织和癌变组织内主要荧光物质的差异,有利于进一步明确自体荧光光谱的本质特征,促进对自体荧光光谱诊断价值的认识。

　　胃肠黏膜细胞外基质分为两部分,即上皮基底膜和间质,胶原作为细胞外基质的主要成分,特别是Ⅳ型胶原(Collagen type,ⅣC)作为细胞外基质中基底膜的主要成分，其在肿瘤组织中的分布异常与肿瘤细胞的生物学特性密切相关。它除了作为结构蛋白对组织起支持作用外,作为自体荧光物质的研究也越来越受到重视。早在20世纪90年代初，Schomacker KT等［10］的研究就证明了胃肠组织的黏膜下层富含大量荧光物质如胶原蛋白、弹力蛋白及NADH等,是产生荧光的主要物质。近年来，Romer TJ等［1,9］在研究胃癌自体荧光光谱时，也发现在胃肠壁的黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜4层结构中，组织自体荧光主要与胃壁的黏膜层及黏膜下层结缔组织纤维(主要是胶原纤维)及肌层滤泡之间嗜酸性胶质粒有关，癌组织固有层中的荧光结缔组织纤维较正常组织要少,从而导致其荧光强度降低。目前在国内，自体荧光的研究才刚刚起步，尽管张阳德［4,5,11］等学者认为Ⅳ型胶原可能是大肠黏膜基底膜产生荧光的主要来源，但在胃癌方面报道甚少，甚至是空白。

　　本部分实验研究结果表明,Ⅲ、Ⅳ型胶原在胃底贲门正常组织的细胞外基质中均有较强的抗体阳性反应；Ⅳ型胶原在基底膜为强阳性反应,呈现环形粗条状染色；Ⅲ型胶原在基质中的染色呈现细丝状。胃底贲门正常组织发生癌变后,Ⅳ型胶原抗体阳性反应在癌组织中显著减少(P＜0.001)，呈阴性反应,或仅存小片段的阳性反应,说明Ⅳ型胶原在癌组织中的含量减少；而Ⅲ型胶原在癌间质中的抗体阳性反应较正常组织变化不明显,或还稍有增强，说明Ⅲ型胶原在癌间质的分布量没有明显的变化。结合显微自体荧光图像分析［12］，胃底贲门组织细胞外基质有较强的荧光信号,所以,笔者认为Ⅳ型胶原可能是胃底贲门组织的细胞外基质产生荧光的主要来源。Ⅳ型胶原荧光物质在正常组织和癌组织中的含量差异,可能是影响正常组织和癌组织自体荧光差异的原因。其发生机制很可能是肿瘤细胞在其浸润转移过程中，肿瘤细胞不可避免地要在基底膜多次发生作用，可通过其细胞表面的受体附着在Ⅳ型胶原等特殊的基质成分上，造成基底膜降解和破坏。另外，根据Ⅲ、Ⅳ型胶原抗体阳性反应在癌组织中的分布特点，分析显微自体荧光图像,正常组织细胞外基质区有很强的自体荧光信号,而在癌组织荧光信号减弱,说明组织癌变后Ⅳ型胶原分布量的减少,是自体荧光强度减弱的主要原因之一。

　　总之，胃肠组织自体荧光可能是胃肠组织中多种物质荧光的重迭效应，并经组织吸收和散射的结果，但因其真实反映组织内固有信息，所以深入细致地了解各荧光物质在组织自体荧光产生过程中的作用大小,并对组织内荧光物质的分子结构和荧光特性进行研究，将有利于直接阐明组织癌变后的自体荧光光谱改变的本质特征，为自体荧光检测肿瘤提供了广阔的前景，特别是为胃肠系恶性肿瘤早期诊断与共聚焦消化内镜新技术［13］开辟了一条新的途径和提供了有力的佐证。

　　【】

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　　3  Botterweck AA,Schouten LJ,Volovics A,et al. Trends in incidence of adenocarcinoma of the esophageal and gastric-cardia in ten European Countries. Int J Epidemiol,2000,29(4):645.

　　4  李静,李世荣,曹建彪,等.胃癌患者癌组织激光诱发荧光光谱的初步探讨.激光医学杂志,1999,8:211-213.

　　5刘蔚东,张阳德,唐贵林,等.结肠早癌自体荧光内镜诊断系统研究Ⅱ:肿瘤组织自体荧光区别于正常组织的机制.中国内镜杂志,2000,2:1-3.

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　　7  Koening F,Mcgovern FJ,Enquist H,et al.Autoflurescence guidedbiopsy for the early diagnosis of bladder carcinoma.The Journal of Urology,1998,159:1871-1875.

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　　9  Romer TJ,Fitzmaurice M,Cothren RM,et al. Laser - induced fluorescence microscopy of normal colon and dysplasia in colonic adenomas:implications for spectroscopic diagnosis.Am J Gastroemterol,1995,90:81-87.

　　10  Schomacker KT,Frisoli JK,Compton CC,et al.Ultraviolet laser-induced fluorescence of colonic tissue.Lasers Surg Med,1992,63(12):78.

　　11  张阳德,刘蔚东,何剪太,等.大肠正常组织和癌组织自体荧光差异病基础.中国内镜杂志,2000,6(5):1-4.

　　12  李威,李欣欣,陈君填,等.贲门癌的显微自体荧光研究.肿瘤防治杂志，2005，12(10):37-42.

　　13  Kiesslich R,Burg J,Vieth M,et al. Confocal laser endoscopy for diagnosing intraepithelial neoplasias and colorectal cancer in vivo. Gastroenterology，2004,127(3):706-713.