调督安神胶囊对PTX致痫大鼠海马神经元NMDAR1的影响

【摘要】  目的 探讨调督安神胶囊对PTX致痫大鼠海马N?甲基D?天冬氨酸受体亚单位NR1(NMDAR1)的影响。方法 建立PTX癫痫大鼠模型，再随机分为模型对照组、中药低剂量组、中药高剂量组、西药组。分别给予双蒸水和调督安神胶囊、西药灌胃。然后进行NMDAR1免疫组织化学染色和免疫阳性细胞记数。结果 PTX致痫大鼠海马NMDAR1表达显著增强，而经过中药后的癫痫大鼠海马NMDAR1阳性细胞数明显减少，接近于正常组。结论 调督安神胶囊可以抑制海马组织中NMDAR1的过度表达，这可能是其改善癫痫大鼠学习和记忆障碍的机制之一。

【关键词】  癫痫 调督安神胶囊 N?甲基D?天冬氨酸受体亚单位NR1(NMDAR1)

【Abstract】  Objective  To observe the effects of Tiaodu Anshen capsule on the NMDAR1 in hippocampus neuron in picrotoxin (PTX)-induced epilepsy rats. Methods  The PTX?induced epilepsy rats were established, and then randomly divided into 4 groups：model control group, Chinese medicine low dosage group, high dosage group and western medicine group.The rats were treated with intragastric administration: Double distilled water ,Tiaodu Anshen capsule and western medicine. The expressions of NMDAR1 in hippocampus neuron were evaluated by immunohistochemistry and the positive neurons were counted. Results  The NMDAR1?positive neurons significantly increased in PTX?induced epilepsy rats, while the NMDAR1?positive neurons in Chinese medicine low and high dosage groups significantly decreased. Conclusion  Tiaodu Anshen capsule can significantly reduce the excessive expressions of NMDAR1 in hippocampus neuron, which is one of the possible mechanisms in Tiaodu Anshen capsule improvement on learning and memory for epilepsy rats.

【Key words】  Epilepsy；Tiaodu Anshen capsule；NMDAR1

    癫痫是一种反复发作、以大脑功能失调为主要表现的神经系统常见病。西医抗癫痫药物虽可使约80%患者得以控制，但其毒副作用及对行为、认识功能的负面影响迫切要求探索安全、高效、毒副作用小的抗癫痫新药及新疗法［1］。中药调督安神胶囊既能很好地控制癫痫发作，又能明显改善癫痫患者的认知状况，本研究通过观察调督安神胶囊对癫痫大鼠海马N?甲基D?天冬氨酸受体亚单位NR1(NMDAR1)表达的影响，以探讨其改善学习、记忆功能的内在机制。

    1  实验材料

    1.1  实验动物  3～4周龄健康SD雄性大鼠40只，清洁级，体重100～120 g，购自河南医科大学实验动物中心，合格证编号：0001513。

    1.2  药物与试剂  调督安神胶囊由河北省中医药研究院制剂室研制，主要组成为：桑寄生、紫河车、川芎、当归、白花蛇、全蝎等。分别配置成每毫升含生药500 mg、250 mg二种高、低浓度的悬浊液，存4℃冰箱备用，灌胃时温服。

    丙戊酸钠：湖南湘中制药有限公司生产，批号：20041206，规格：200 mg/片。脑复康：天津金世制药有限公司生产，批号：2000409，规格：400 mg/片。加蒸馏水配置成每毫升含丙戊酸钠20 mg、脑复康40 mg的悬浊液，存4℃冰箱备用，灌胃时温服。

    印防己毒(picrotoxin，PTX)：购自Sigma公司，规格：1 g/瓶。PTX溶于生理盐水，配置成0.01%溶液，存4℃冰箱备用，按1.5 mg/kg/d腹腔注射。

    兔抗大鼠NMDAR1抗体购自精美生物工程有限公司，存-20℃冰箱备用。

    2  实验方法

    2.1  动物分组  40只SD大鼠，随机分为Ａ组(正常对照组)8只，PTX点燃组32只，造模成功后点燃组再随机分为4组，每组8只，分别为：Ｂ组(模型对照组)，C组(中药低剂量组)，D组(中药高剂量组)，E组(西药组)。

    2.2  造模方法  采用PTX腹腔注射点燃癫痫模型方法。按照Shandra［2］、田发发［3］等的实验方法进行， PTX点燃组每天上午9∶00～10∶30腹腔注射PTX，每次注射前为SD大鼠称重，以便PTX量与大鼠体重增加相适应。连续注射20～30 d；A组腹腔注射等量的生理盐水，每天逐个动物观察、记录。点燃行为依据Racine［4］分级标准，凡已获得连续5次２级或２级以上完全发作者，被认为完全点燃，符合点燃标准的点燃组大鼠继续予以原剂量注射，实际取材持续30 d。

    2.3  用药方法  各组于点燃后开始连续灌胃，1次/d，共持续60 d。剂量：A、B组灌服生理盐水2 ml/(100 g·d)；C、D组分别灌服低、高浓度调督安神胶囊悬浊液2 ml/(100g·d)；E组灌服含丙戊酸钠和脑复康的悬浊液，2 ml/(100g·d)。期间大鼠自由摄食与饮水。

    2.4  脑组织灌注和取材  用药结束后各组大鼠均进行麻醉，成功后以4℃的4%多聚甲醛(PF)-0.1 mol/L磷酸缓冲液(PH 7.4)500 ml进行脑组织灌注，灌注后取嗅脑至中脑之间脑组织。

    2.5  切片  从脑组织视交叉冠状平面开始连续切片，切至出现海马结构，切片经过充分漂洗后，进行免疫组化反应。

    2.6  免疫组织化学染色  一抗为兔抗大鼠NMDAR1抗体，4℃孵育36 h；生物素化二抗，室温孵育3 h；SABC复合物(1︰200，含0.5% Triton)室温孵育2 h；0.05％ DAB和0.03％ H2O2混合液显色5～10 min；裱片于挂有1%明胶的载玻片上，烘干，脱水，封片。阴性对照用PBS代替一抗，同步进行免疫组织化学染色，步骤相同。

    3  检测指标

    光镜下(20×10)对各组切片的免疫阳性细胞数进行记数。选择海马同一阶段的CA3区进行记数，每一张脑片随机选取5个视野，测量统一视野内阳性细胞数，取其算术平均值进行统计学分析。实验数据以±s表示，使用statistic(5.0)统计软件对数据进行分析，采用单因素方差分析。

    4  结果

    NMDAR1免疫阳性神经元主要分布在皮层和海马CA1、CA2、CA3区和齿状回。光镜下可见海马免疫阳性细胞被染成棕黄色，NMDAR1主要表达于胞膜、胞浆。与正常对照组比较，模型对照组的海马CA3区NMDAR1免疫阳性细胞数明显增高，有统计学意义上的差异(P<0.05)。与模型对照组比较，中药低剂量组、中药高剂量组、西药组海马CA3区NMDAR1免疫阳性细胞数均有不同程度的下降，其中中药高剂量组的下降最为显著，与模型对照组比较有统计学意义上的差异(P＜0.05)，与A组比较差异没有统计学意义(P＞0.05)。说明高剂量的调督安神胶囊能够明显抑制NMDAR1的高水平表达，并使其表达水平接近于正常。结果见表1，图1(见封2)。表1  五组大鼠海马CA3区NMDAR1阳性细胞数比较(略)注：与A组比较，*P<0.05，与B组比较，ΔP<0.05

    5  结论

    谷氨酸(L?glutamic acid，GLU)是中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质，其受体在调节学习记忆的过程中起着重要作用，其中离子型受体NMDA被认为是影响学习记忆的关键物质。NMDA受体广泛分布于中枢神经系统，尤以海马区最丰富。神经电生理研究表明，大脑海马长时程增强(long?term potentiation，LTP)是记忆形成和巩固过程中神经元活动的客观指标，而LTP的形成依赖于NMDA受体的激活。一方面学习记忆必须依赖NMDA受体的激活；但NMDA受体的过度表达则会影响LTP的形成，导致学习记忆障碍。大量研究也证实，在一些癫痫模型中，兴奋性氨基酸合成、释放增加，使NMDA 受体活性增高，NMDA 受体过度兴奋一方面使癫痫发作易感性增加，另一方面造成了癫痫发作后的学习记忆功能的障碍。NMDA受体的基本单位是NR1［5］，因此研究NMDAR1对了解NMDA受体具有重要的意义。本研究通过动物实验观察到中药调督安神胶囊能明显降低癫痫大鼠海马区NMDAR1的表达，使其接近于正常水平，从而发挥其调节学习记忆的能力，这可能是调督安神胶囊是改善癫痫认知障碍中的一个重要机制。

【】
  1 姚凤莉，李海南，马融．抗痫增智颗粒对点燃大鼠模型学习记忆功能的影响．中医急症，2004，13(4)：238?239．

2 Shandra AA，Mazarati AM，Godlevsky LS，et al. Chemical kindling：implications for antiepileptic drugs sensitive and resistant epilepsy model．Epilepsia，1996，37(3)：269?274．

3 田发发，谢光洁，杨期东，等. 实验性癫痫与γ?氨基丁酸和谷氨酸脱羧酶的关系．中华神经科杂志，2000，33(4)：4225?4226．

4 Racine RJ．Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol,1972，32(3)：281?294．

5 张敏．海马缺血性损伤中谷氨酸Glu及其NMDA受体的作用．齐齐哈尔医学院学报，2006，27(15)：1797?1799．