干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响因素

                 作者：陆琰 综述， 张洹， 姜铧

【关键词】  干细胞；糖尿病；分化

    干细胞是一群较原始的细胞，具有高度的自我更新及分化的能力，可以在体内外向多系组织细胞分化，这使得干细胞成为新型胰岛素分泌细胞的最佳来源。干细胞之所以能向特定的组织或细胞分化，这是由细胞内外的众多因素所决定的。它们可以调节细胞内特定的基因表达，从而产生不同的特异性结构蛋白和酶，使细胞获得特定的表型特征以及功能。这些因素包括了细胞间的相互作用，细胞与细胞外基质之间的作用，多肽，生长因子，细胞因子，激素，小分子化合物（如营养物质、代谢物、酸、合成药物）等等[1]。在干细胞向胰岛素分泌细胞的分化过程中，有众多影响因素参与了分化调控，本文将对此进行综述。

    1  培养基和血清

    目前能在体外成功将干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究，它们一般所采用的培养基都是几种常见的细胞培养基，有RPMI1640，DMEM，DMEM/F12，CMRL 1066等。这些研究以这几种常用细胞培养基为基础，在里面添加适当的诱导因子，从而将干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。而且，有不少研究认为，低浓度血清甚至是无血清诱导是诱导分化的关键[2]。血清中可能含有促进增殖、抑制分化的因子，因此采用无血清培养基更能促进细胞分化。

    2  营养物质

    2.1  葡萄糖

    葡萄糖不仅仅是细胞的营养物质，而且在诱导分化中起重要作用。以往的研究认为糖是刺激β细胞生长分化的重要因素[3]。在体外和体内，20～30 mmol/L浓度的葡萄糖可以促进β细胞的复制，对于β细胞来说，葡萄糖是一种重要的生长因子[4]。葡萄糖可促进β细胞生长外，还可以促进β细胞的分化[5]。根据Tang[4]等的报道，一株大量表达PDX?1的肝干细胞株（WB细胞）仅仅产生了胰腺的前体细胞，这些细胞在体外并无糖反应性。而当这些细胞在高糖环境诱导下或移植到糖尿病小鼠体内后，就具备了完整的功能。高糖诱导还能使β细胞的功能趋于成熟。但是对于高糖影响β细胞生长分化的机制仍有争论。部分研究认为，当细胞外糖浓度提高时，糖将会迅速进入β细胞内，并且被糖酵解途径中的葡萄糖激酶分解，使ATP/ADP比率升高，二腺苷多聚磷酸浓度增加[6]。这些变化将阻断ATP依赖的K+通道，使细胞膜去极化，打开电压依赖的L型Ca2+通道，使得胞内Ca2+增加，激活与胞吐作用相关的蛋白，刺激胰岛素释放[7]。

    但是长期处于高血糖环境对于β细胞的影响仍存在着争论，有的研究者认为高糖[8]对人的胰岛形态及DNA含量无明显改变，却可以降低胰岛素的含量，且对糖刺激的反应性下降。因此，部分研究者认为应该在诱导后期减低葡萄糖浓度，联合其他诱导因子，修复β细胞对糖刺激的敏感性，从而使诱导后的细胞对糖刺激的反应性更接近于生理需求[9]。

    2.2  尼克酰胺(nicotinamide,NIC)

    NIC是维生素B3的一种形式，是一种ADP-核糖合成酶抑制剂,通过其主要代谢产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）参与广泛的生命活动，包括营养代谢、信号转导、维持基因组的完整等[10]。NIC能诱导人类胚胎胰岛内分泌细胞的分化和成熟[11]，保护β细胞在长期高糖情况下避免脱敏[12]。在几种不同的动物1型糖尿病模型中，NIC显示出抗糖尿病的潜能。但是其作用机制尚未明确。有的研究者提出，这可能是由于它具有清除自由基的作用，而且能减轻β细胞的免疫损伤[13]。部分体外研究表明，NIC可以抑制MHC Ⅱ类分子在胰岛的表达，预防巨噬细胞的浸润以及白介素1β介导的损伤[14]，这些作用都能减轻β细胞所受到的免疫损伤。另外，NIC能刺激胰岛细胞的复制，诱导人胎胰内分泌细胞的分化和成熟。

    2.3  全反式维甲酸（all?trans?retinoic acid,ATRA）

    ATRA在体内对中、外胚层的发育起重要的作用，一般常用于体外向神经细胞分化的实验中。最近有研究表明，ATRA也参与内胚层的组织细胞分化，它在早期胚胎胰腺发育过程中是一个重要的信号分子[15]。Shi等[16]利用ATRA联合激活素A将小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞进行诱导分化。虽然其作用机制尚未明确，但研究者认为这可能是由于ATRA作用于核受体，从而激活特定的基因。

    3  丁酸钠

    丁酸钠是一种短链脂肪酸，是组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂，可以通过调节基因表达来调控细胞的增殖、分化。它可以促进胰岛细胞的分化[17]，增加胰岛细胞中的胰岛素含量以及β细胞的基因表达[18]。虽然它有利于β细胞的分化，但是它也能促进细胞的凋亡[19]。因此，丁酸钠常与其他诱导因子联用进行体外诱导。

    4  胰高血糖素样肽1（glucagon?like peptide?1,GLP?1）

    GLP?1是胰高血糖素原基因翻译后的加工产物，属于前胰高血糖素分子衍生的一种激素[20]。它可以刺激β细胞的增殖、分化，抑制凋亡[21]；而且可以促进胰岛素基因的转录，促进β细胞分泌胰岛素。GLP?1主要是通过胰十二指肠同源框?1(pancreatic duodenal homeobox?1,PDX?1)发挥促进β细胞分化的作用。PDX?1是胰腺发育中的重要调控因素。GLP?1可以促进PDX?1的合成，促使PDX?1迅速转移到细胞核内，提高PDX?1与胰岛素基因启动子的结合活性[22]。

    5  生长因子

    5.1  表皮生长因子（epidemal growth factor,EGF）

    EGF可以促进有丝分裂活性，对多种表皮细胞和上皮细胞，甚至是祖细胞的生长有刺激作用，参与损伤的修复。EGF信号途径是通过c?erbB受体发挥作用的。有研究表明，EGF可以令内分泌细胞减少，上皮细胞增殖而不分化；当EGF撤离后，细胞就会开始向胰岛素分泌细胞分化[23]。

    5.2  β细胞调节素（betacellulin,BTC）

    BTC是EGF家族的成员，它可以促进胰岛细胞增殖[24]，诱导导管细胞分化。另外，BTC可以上调胰腺发育中的重要基因Pax?4的表达，而且通过对抗由细胞因子引起的凋亡，保护胰岛细胞[25]。

    5.3  肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）

    HGF是间充质分泌的一种细胞因子，对成年胰岛细胞是一种胰岛素亲和因子，可以诱导胰岛素表达。HGF在胰岛β细胞中高表达，可导致β细胞有丝分裂及抗凋亡。在胰腺发育中，可以作为一种信号蛋白，在上皮和间质相互作用中起作用。而且HGF可以促进胚胰β细胞以及成人导管细胞的增殖。

    5.4  激活素A（activin A）

    激活素A是转化生长因子（transforming growth factor,TGF）β家族成员，其受体在胚胎和成体胰岛的α和δ细胞中表达，它对细胞的增殖、分化、凋亡都起着重要作用。激活素A和BTC或HGF合用可以将胰腺细胞系AR42J转化为胰岛素分泌细胞，诱导人胎儿胰腺内分泌细胞的分化[26]。

    6  合成药物LY294002

    LY294002是磷酸肌醇3?激酶（phosphoinositide 3?kinases,PI3Ks）抑制剂，能增加内分泌细胞的总数及胰岛素含量；使用该诱导剂后，显著地提高了诱导后细胞的胰岛素含量及分泌水平[27]。PI3K信号途径可以参与细胞的增殖、凋亡、有丝分裂以及黏附。在β细胞中，PI3K信号途径可以调节ATP依赖的K+通道、电压依赖的Ca2+通道，参与胞吐作用和相关的糖代谢[28]。通过抑制胎胰细胞的PI3K信号途径，可以增加胰岛素mRNA、胰岛素的含量以及分泌量[29]。

    7  细胞外基质

    细胞外基质对于胰腺的发育也起着调控作用。在没有基质的情况下，分离的胰腺上皮不能分化胰腺组织，无论是外分泌组织还是内分泌组织。而且两种分泌组织所需的基质来源信号不同。另外，细胞外基质对于胰腺前体细胞的迁移、分化，形成胰岛结构也有着重要的作用。有研究者[30]利用基质Matrigel联合其他因子，将人胰腺导管细胞诱导为胰岛素分泌细胞。

    综上所述，以上这些影响因素其实是通过调节代谢、信号转导以及调节基因表达，从而参与细胞增殖、分化、凋亡的调控。这些因素当中，有的可以促进β细胞增殖，有的可以诱导细胞分化，而有的则既可以促进细胞增殖，也能诱导分化。将各种因素相互搭配，将能更好地发挥其作用。我们可以采用两步法对干细胞进行诱导分化，先启动分化，然后促进细胞成熟。如丁酸钠联合NIC，GLP?1联合NIC能更有效的促进分化。

    另外，现阶段干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的方法大致有两种，它们各有优缺点。一种是利用基因工程改造细胞，转入外源性胰岛素基因或者胰腺发育的相关基因。目前，利用病毒载体转入基因的转染效率较以往传统的非病毒载体的转染效率有所提高，但是外源基因容易丢失，难以持续有效表达；再者，细胞分化调控是多因素、多基因参与的生命活动，转入外源基因的数量有限，因此影响了细胞的分化效率。有研究表明单纯转基因方法难以得到功能完善的细胞，合适的环境对细胞分化非常重要，而且病毒载体的安全性有待进一步研究。另一种方法则是改变干细胞生长的环境，添加或者去除某些影响因素。此方法较前一方法安全，但是由于这些因素的作用机制大都尚未明确。如何把它们运用得更恰当，使诱导分化效率提高，是亟需解决的问题。比如，各种因素如何联合应用，用量多少，应用的时间长短等等。在以后的研究工作中我们可以将两者相结合，取其优点，去其弊端，使诱导更安全，更高效。如，运用腺病毒载体转入PDX?1基因，然后在高糖环境下联合GLP?1、ATRA、激活素A等启动分化，再以低糖配合LY294002、NIC等促进细胞成熟，增加胰岛素分泌量。干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的研究目前仍处于起步阶段，有许多问题需要继续探讨，而转基因技术结合诱导剂诱导将是提高分化效率的有效手段。

【】
  [1]Roche E,Sepulcre MP,Ensenat?Waser R,et al.Bio?engineering inslulin?secreting cells from embryonic stem cells:a review of progress[J].Med Biol Eng Comput,2003,41(4):384-391.[2]Zalzman M,Anker?Kitai L,Efrat S.Differentiation of human liver?derived insulin?producing cells toward the β?cell phenotype[J].Diabetes,2005,54(9):2 568-2 575.[3]Bonner?Weir S.Islet growth and development in the adult[J].J Mol Endocrinol,2000,24(3):297-302.[4]Tang DQ,Cao LZ,Burkhardt BR,et al.In vivo and in vitro characterization of Insulin?producing cells obtained from murine bone marrow[J].Diabetes,2004,53(7):1 721-1 732.[5]Yang L,Li S,Hatch H,et al.In vitro trans?differentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic endocrine hormone?producing cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(12):8 078-8 083.[6]Nadal A,Rovira JM,Laribi O,et al.Rapid insulinotropic effect of 17 beta?estradiol via a plasma membrane receptor[J].FASEB J,1998,12(13):1 341-1 348.[7]Rorsman P,Renstrom E.Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells[J].Diabetologia,2003,46(8):1 029-1 045.[8]Eizirik DL,Korbutt GS,Hellerstrom C.Prolonged exposure of human pancreatic islets to high glucose concentrations in vitro impairs the beta?cell function[J].J Clin Invest,1992,90(4):1 263-1 268.[9]Segev H,Fishman B,Ziskind A,et al.Differentiation of human embryonic stem cells into insulin?producing clusters[J].Stem Cells,2004,22(3):265-274.[10]Ziegler M.New functions of a long?known molecule：emerging roles of NAD in cellular signaling[J].Eur J Biochem,2000,267(6):1 550-1 564.[11]Otonkoski T,Beattie GM,Mally MI,et al.Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells[J].J Clin Invest,1993,92(3):1 459-1 466.[12]Ohgawara H,Kawamura M,Honda M,et al.Reversal of glucose insensitivity of pancreatic B?cells due to prolonged exposure to high glucose in culture: effect of nicotinamide on pancreatic B?cells[J].Tohoku J Exp Med,1993,169(2):159-166.[13]LeDoux SP,Hall CR,Forbes PM,et al.Mechanisms of nicotinamide and thymidine protection from alloxan and streptozocin toxicity[J].Diabetes,1988,37(8):1 015-1 019.[14]Yamada K,Miyajima E,Nonaka K.Inhibition of cytokine?induced MHC class II but not class I molecule expression on mouse islet cells by niacinamide and 3?aminobenzamide[J].Diabetes,1990,39(9):1 125-1 130.[15]Stafford D,Prince VE.Retinoic acid signaling is required for a critical early step in zebrafish pancreatic development[J].Curr Biol,2002,12(14):1 215-1 220.[16]Shi Y,Hou L,Tang F,et al.Inducing embryonic stem cells to differentiate into pancreatic beta cells by a novel three?step approach with activin A and all?trans retinoic acid[J].Stem Cells,2005,23(5):656-662.[17]Otonkoski T,Ustinov J,Huotari MA,et al.Nicotinamide and sodium butyrate for the induction of fetal porcine beta?cell differentiation prior to transplantation[J].Transplant Proc,1997,29(4):2 045.[18]Fernandez Mejia C,Davidson MB.Effect of sodium butyrate on glucose transport and glucose?phosphorylating enzymes in RIN?m5F cells[J].Pancreas,1993,8(5):589-596.[19]Otonkoski T,Ustinov J,Rasilainen S,et al.Differentiation and maturation of porcine fetal islet cells in vitro and after transplantation[J].Transplantation,1999,68(11):1 674-1 683.[20]闫 磊，慕晓玲.胰高血糖素样肽1与干细胞定向分化[J].生物工程杂志,2007,27(4):115-119.[21]Brubaker PL,Drucker DJ.Glucagon?like peptides regulate cell proliferation and apoptosis in the pancreas,gut and central nervous system[J].Endocrinology,2004,145(6):2 653-2 659.[22]Wang X,Zhou J,Doyle ME,et al.Glucagon?like peptide?1 causes pancreatic duodenal homeobox?1 protein translocation from the cytoplasm to the nucleus of pancreatic beta?cells by a cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A?dependent mechanism[J].Endocrinology,2001,142(5):1 820-1 827.[23]Cras?Méneur C,Elghazi L,Czernichow P,et al.Epidermal growth factor increases undifferentiated pancreatic embryonic cells in vitro: a balance between proliferation and differentiation[J].Diabetes,2001,50(7):1 571-1 579.[24]Li WC,Horb ME,Tosh D,et al.In vitro transdifferentiation of hepatoma cells into functional pancreatic cells[J].Mech Dev,2005,122(6):835-847.[25]Brun T,Franklin I,St?Onge L,et al.The diabetes-linked transcription factor PAX4 promotes beta?cell proliferation and survival in rat and human islets[J].J Cell Biol,2004,167(6):1 123-1 135.[26]Demeterco C,Beattie GM,Dib SA,et al.A role for activin A and betacellulin in human fetal pancreatic cell differentiation and growth[J].J Clin Endocrinol Metab,2000,85(10):3 892-3 897.[27]Hori Y,Rulifson IC,Tsai BC,et al.Growth inhibitors promote differentiation of insulin?producing tissue from embryonic stem cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(25):16 105-16 110.[28]Barker C,Leibiger I,Leibiger B,et al.Phosphorylated inositol compounds in beta?cell stimulus?response coupling[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2002,283(6):1 113-1 122.[29]Ptasznik A,Beattie GM,Mally MI,et al.Phosphatidylinositol 3?kinase is a negative regulator of cellular differentiation[J].J Cell Biol,1997,137(5):1 127-1 136.[30]Bonner?Weir S,Taneja M,Weir GC,et al.In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(14):7 999-8 004