丹参注射液对哮喘大鼠肺IL?13和嗜酸性粒细胞趋化因子表达的影响

                  作者：王成国, 薛克营, 程立, 李威, 石明

【摘要】  目的:探讨丹参注射液抑制哮喘气道变应性炎症作用的分子机制。方法:30只SD大鼠随机分成正常对照组、哮喘组和丹参组。HE染色行肺组织病检查，计数支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数并分类，SP法和RT?PCR测定肺组织中IL?13和嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）表达。结果:丹参组肺组织炎性细胞浸润明显减少，BALF细胞总数及淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(Eos)百分率较哮喘组明显减少(P＜0.05，P＜0.01)。哮喘组肺组织IL?13和Eotaxin表达较正常对照组明显增加(P＜0.05)，丹参组IL?13和Eotaxin表达较哮喘组明显减少(P＜0.05)。IL?13和Eotaxin表达呈正相关（r=0.90，P＜0.01）。结论:丹参注射液可减轻哮喘大鼠气道炎症反应，其机制可能与降低哮喘大鼠肺内IL?13和Eotaxin表达有关。

【关键词】  丹参注射液；哮喘；IL?13；嗜酸性粒细胞趋化因子

    Abstract: Objective To investigate the molecular mechanism of inhibitory effect of Danshen injection on allergic airway inflammation of asthma.Methods Thirty SD rats were randomly divided into control group,asthma group and Danshen injection group.Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected,and cytology analysis was performed.The lung tissue was harvested and stained with HE.Interleukin?13 (IL?13) and Eotaxin in lung tissue were measured by RT?PCR and SP method of immunohistochemistry assay. Results Compared with the asthma group,less infiltration of inflammatory cells in lung tissues was observed in Danshen injection group.Total cell number,the percentage of lymphocytes,neutrophils and eosinophils in BALF of Danshen injection group were lower than that of asthma group (P﹤0.05,P﹤0.01).The expression of IL?13 and Eotaxin in lung tissue of asthma group were higher than that of control group and Danshen injection group (P﹤0.05).The expression of IL?13 was negatively correlated with Eotaxin (r=0.90, P﹤0.01).Conclision Danshen injection could suppress airway inflammation of asthmatic rats,probably by decreasing the expression of IL?13 and Eotaxin in lung tissue of asthmatic rats.

    Key words:Danshen injection;Asthma;Interleukin?13;Eotaxin 

     支气管哮喘是由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子参与的气道慢性炎症性疾病，其中白介素?13（IL?13）和嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotxin）是致哮喘重要因素。丹参注射液治疗哮喘疗效明显，但其机制不明。本研究通过建立哮喘大鼠模型，检测其肺组织IL?13和Eotaxin的表达，以探讨丹参注射液抑制支气管哮喘气道变应性炎症作用的分子机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物和药物

    健康雄性SD大鼠，体重（250±20） g，SPF级（同济医学院实验动物中心）。随机分为正常对照组、哮喘组和丹参治疗组，每组10只。

    丹参注射液（开开援生制药股份有限公司，2 mL/支，含生药丹参1.5 g/mL）；卵白蛋白（OVA，美国Sigma公司）；兔抗鼠IL?13多克隆抗体、兔抗鼠Eotaxin多克隆抗体购自武汉博士德生物公司；Trizol（上海华舜生物工程有限公司）；PT?PCR试剂盒（美国Promega公司）；IL?13和Eotaxin　mRNA引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

    1.2  动物模型制备

    哮喘大鼠模型的制备方法参照[1]进行。大鼠皮下注射含10 mg OVA和200 mg Al(OH)3的生理盐水1 mL，同时腹腔注射百日咳杆菌疫苗1mL（含菌约6×109个/mL）作为免疫增强剂，第8 d重复致敏一次，第15 d天开始激发。

    将大鼠置于特制的玻璃容器内，用超声雾化器喷入2％ OVA生理盐水50 mL，每次30 min，每周3次,连续4周。激发后大鼠出现哮喘症状如躁动不安、咳嗽、呼吸急促、紫绀等，证实模型制作成功。正常对照组用生理盐水代替OVA注射和吸入。丹参治疗组每次OVA激发前30 min腹腔内注射20％丹参注射液3 mL[2]。

    1.3  BALF细胞计数及分类

    于末次激发24 h后，将大鼠麻醉后（3％水合氯醛）开胸，气管切开，将塑料导管插入右主支气管内，用无菌生理盐水5 mL行支气管肺泡灌洗，反复抽吸3次，抽取回收液（即BALF）约4.8 mL，回收率96％。取摇匀的BALF少许滴于细胞计数板上，光镜下计数细胞总数，然后将BALF离心（1 000 r/min）10 min，离心后沉渣进行涂片、瑞氏染色，油镜下计数200个细胞并分类。

    1.4  肺组织HE染色

    取左肺中央组织100 mg冷冻于-80 ℃冰箱用于RT?PCR检测，余组织10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，行HE染色，光镜观察。

    1.5  肺组织IL?13、Eotaxin蛋白检测

    取左肺组织切片，常规脱蜡至水，枸椽酸盐缓冲液冲洗，微波修复，加一抗（稀释度为1∶100），DAB显色，阴性对照以PBS代替一抗。每张切片选取6个具有代表性的视野（×400），图像分析系统自动选取阳性区域并平均光密度值（AOD）。

    1.6  肺组织IL?13、Eotaxin　mRNA含量测定

    采用逆转录?聚合酶链式反应（RT?PCR）法，取冻藏的左肺中央组织100 mg，室温融化后加入1 mL Trizol提取总RNA，紫外线分光光度法测定RNA纯度和含量。取5 μg RNA在oligo?dT和M?Mulv存在的情况下进行逆转录反应合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。

    引物序列：IL?13  正义5′?TCGCTTGCCTTGGTGGTCTT?3′，反义5′?GGATGGCATTGCAACTGGAG?3′，长度219 bp；Eotaxin   正义5′?CTCCACAGCACTTCTATTCC?3′，反义5′?TTTGGAGTTTTTGGTCCAGG?3′，长度272 bp；GAPDH  正义5′?AACTTTGGCATCGTGGAAGG?3′，反义5′?TTTGGAGTTTTTGGTCCAGG?3′，长度622 bp。

    按各自反应条件（IL?13扩增条件：95 ℃预变性5 min,94 ℃ 60s, 56 ℃ 60 s, 72 ℃ 60 s,共35个循环，72 ℃延伸10 min。Eotaxin扩增条件：95 ℃预变性5 min,94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s, 共35个循环，72 ℃延伸10 min。）扩增，PCR产物在１%琼脂糖凝胶上电泳，以GAPDH为阳性对照，凝胶成像、条带密度扫描，以IL?13/GAPDH和Eotaxin/GAPDH积分光密度的比值进行半定量分析。

    1.7  统计学处理

    应用SPSS 12.0统计软件，进行方差分析和q检验，两变量的相关关系用直线相关关系法进行分析。

    2  结果

    2.1  BALF细胞计数及分类

    见表1，哮喘组BALF细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞百分率、Eos百分率均高于正常对照组(P<0.05，P<0.01)。丹参组细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞百分率和Eos百分率则较哮喘组下降(P<0.05，P<0.01)。表1  BALF细胞总数及分类计数的比较注：哮喘组与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；丹参治疗组与哮喘组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

    2.2  肺组织病理改变

    正常对照组大鼠支气管粘膜上皮、粘膜肌层完好，支气管管腔规则，周围无明显炎症细胞浸润，管腔内无明显分泌物贮留（图1）；哮喘组大鼠支气管收缩，管腔狭窄，支气管壁内大量炎症细胞浸润，粘膜上皮坏死脱落，基底膜暴露，支气管内分泌物贮留（图2）；与哮喘组比较，丹参治疗组大鼠支气管壁的损伤明显减轻，管壁周围的炎症细胞浸明显减少（图3）。

    2.3  大鼠肺组织IL?13、Eotaxin蛋白的含量

    哮喘组大鼠肺组织IL?13、Eotaxin蛋白的含量明显高于正常对照组(P<0.05)；但丹参治疗组IL?13、Eotaxin蛋白的含量哮喘组比较明显下降(P<0.05)（表2）。表2  各组大鼠肺组织IL?13、Botaxin蛋白 表达比较注：与正常对照组比较， *P＜0.05；与哮喘组比较 △P＜0.05

    2.4  各组大鼠肺组织IL?13、Eotaxin mRNA表达

    见图1。哮喘组大鼠肺组织IL?13、Eotaxin mRNA的含量明显高于正常对照组（P＜0.05）；与哮喘组比较，丹参治疗组IL?13、Eotaxin mRNA的含量明显明显下降（P＜0.05）。

    2.5  IL?13和Eotaxin表达的相关性

    应用SPSS 12.0统计软件，进行IL?13和Eotaxin相关性分析，发现IL?13和Eotaxin表达呈正相关（r=0.90，P＜0.01）。

    3  讨论

    支气管哮喘发病率近年来逐年增高[3]。它是由多种细胞、因子和炎症介质引起、以Eos浸润为主、以气道高反应性（AHR）及可逆性气道阻塞为特征的慢性气道炎症性疾病，其中细胞因子及趋化因子在哮喘炎症形成中起重要作用。Eos浸润是支气管哮喘气道病理改变的主要特征，其靶细胞是Th2细胞诱发Eos炎症反应。T淋巴细胞和Eos相互作用是哮喘发病的中心环节。IL?13是近年来最受重视的Th2细胞因子，被认为是与哮喘发病直接相关的Th2因子，它调节嗜酸性粒细胞性炎症反应、黏液分泌和气道高反应性[4]。Eotaxin对Eos有特异性趋化作用，并且对Eos的趋化作用强于其它趋化因子。Eotaxin在支气管哮喘患者中是一个重要致病因子，它趋化Eos和其它炎症细胞在支气管肺组织内聚集，血清中Eotaxin的表达水平与哮喘临床严重程度密切相关[5]。付杰伟等[6]报道哮喘患者痰中Eotaxin表达水平与哮喘急性发作有关。IL?13和Eotaxin两者在外周血和组织中相互作用，共同调节Eos的募集，在哮喘的发病中起重要作用；IL?13是Eotaxin的强诱导剂，它可上调Eotaxin mRNA和蛋白的表达，在气道平滑肌中通过有丝分裂原激活蛋白和信号传导转录激活因子?6(STAT6)信号传导途径刺激Eotaxin释放[7]，阻断IL?13或Eotaxin通路可减少Eos的数量，对支气管哮喘产生治疗作用[8]。

    糖皮质激素被认为是目前哮喘治疗中最有效的药物，研究表明其可通过下调IL?13和Eotaxin表达而发挥降低AHR、抑制气道变态反应的作用[9]。但长期大剂量使用毒副反应大，因此防治哮喘应发挥中医药优势，进行中西医结合，优势互补，以提高疗效，减轻激素的副作用。

    丹参注射液具有降低毛细血管通透性、改善微循环、保护肺功能、抗氧自由基、抗炎等作用。临床观察发现其辅助用于支气管哮喘、慢性喘息性支气管炎，肺心病、肺炎等呼吸系统疾病，具有较好疗效，且成本低、副作用小，可以长期使用。丹参治疗哮喘的药理机制可能是：⑴具有抗过敏及稳定肥大细胞的作用;⑵抑制磷酸二脂酶的活性，使细胞内cAMP增加，抑制细胞外钙内流及细胞内贮钙释放，降低细胞内游离钙浓度，降低细胞兴奋性，从而抑制生物活性物质的释放，抑制气道高发应性，改善肺的通气功能;⑶有效清除氧自由基，保护毛细血管内皮细胞和肺上皮细胞的作用，对放射性肺损伤有预防作用;⑷具有降低血液黏滞度，调节红细胞的电泳率及压积，增加红细胞变形能力;⑸扩张血管，改善微循环;⑹降低中性粒细胞的趋化性，抑制溶酶体酶的释放。但其抗哮喘的分子机制报道较少。

    本研究通过建立哮喘大鼠模型，用丹参注射液进行干预，发现丹参治疗组BALF细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞百分率下降，Eos百分率明显下降；病理组织学显示大鼠支气管壁的损伤明显减轻，管壁周围的炎症细胞浸明显减少，说明丹参注射液可抑制哮喘大鼠的气道炎症反应。丹参治疗组肺组织IL?13和Eotaxin表达较哮喘组明显减少，且IL?13和Eotaxin表达呈明显正相关。推测丹参注射液可以通过下调哮喘大鼠肺组织IL?13和Eotaxin表达而发挥抑制哮喘气道炎症反应的作用。

【】
  [1]Salmon M,Walsh DA,Koto H,et al.Repeated allergen exposure of sensitized Brown?Norway rats induces airway cell DNA synthesis and remodeling[J].Eur Respir J,1999,14(3):633-641.[2]金 毅，徐永健，张珍祥.哮喘大鼠肺泡巨嗜细胞蛋白激酶C?α表达及丹参对其影响[J].组织化学与细胞化学杂志,2000,9(1):74-77.[3]杨 昆，黄绍光.支气管哮喘流行变化趋势分析[J].中华结核和呼吸杂志,2001,24(3):181-183.[4]Wynn TA.IL?13 effector functions[J].Annu Rev Immunol,2003,21:425-456.[5]刘中娟，任艳丽，林嘉友，等.哮喘患者血清嗜酸性粒细胞趋化蛋白测定及其临床诊断价值[J].中国医学院学报,2004,26(3):298-301.[6]付杰伟，陈 平，向旭东.嗜酸性粒细胞趋化因子在哮喘、慢性支气管炎患者诱导痰中的表达及其与气道炎症的关系[J].中华结核和呼吸杂志,2002,25(1):29-32.[7]Peng Q,Matsuda T,Hirst SJ.Signaling pathways regulating interleukin?13?stimulated chemokine release from airway smooth muscle[J].Am J Respir Crit Care Med,2004,169(5):596-603.[8]Mattes J,Foster PS.Regulation of eosinophil migration and Th2 cell function by IL?5 and eotaxin[J].Curt Drug Targets Inflamm Allergy,2003,2(2):169-174.[9]Eum SY,Maghni K,Hamid Q,et al.Inhibition of allergic airways inflammation and airway hyperresponsiveness in mice by dexamethasone: role of eosinophils, IL?5, eotaxin, and IL?13[J].J Allergy Clin Immunol,2003,111(5):1 049-1 061.