鱼腥草素衍生物对TNF?α诱导的大鼠血管平滑肌细胞Syndecan?4 表达的影响

             作者：王峰,欧阳平,左 琦,彭文烈, 贝伟剑，张建兴,赖文岩,许顶立

【摘要】  目的 观察一种鱼腥草素衍生物(houttuyfonate derivative, HD)对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF?α)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖及Syndecan?4 表达的影响。方法 以终浓度分别为TNF?α 20 ng/mL、HD 4 μg/mL、HD 8 μg/mL、TNF?α20 ng/mL+HD 4 μg/mL及TNF?α 20 ng/mL+HD 8 μg/mL对体外培养的VSMCs作用24 h，并设立相关对照组，用MTS/PMS法检测VSMCs的增殖，用Western blot蛋白免疫印迹法测定Syndecan?4 的表达情况。结果 与对照组相比，HD各剂量组单独应用对VSMCs的增殖无明显作用(P>0.05)；HD 4 μg/mL和8 μg/mL可分别抑制TNF?α对VSMCs的增殖作用(P<0.05)。Western blot测定显示：与对照组相比，HD各剂量组单独应用对Syndecan?4 的表达无明显影响(P>0.05)，HD 4 μg/mL和8 μg/mL均可抑制TNF?α刺激后Syndecan?4 的表达(P<0.05)。结论 HD对TNF?α刺激后的VSMCs的增殖及Syndecan?4 表达均有抑制作用。

【关键词】  Syndecan?4 ；鱼腥草素衍生物；TNF?α；血管平滑肌细胞；细胞增殖

Abstract:Objective To investigate the effects of a new houttuyfonate derivative (HD) on proliferation of VSMCs and expression of Syndecan?4  induced by TNF?α in vitro. Methods Rat VSMCs were cultured and exposed to TNF?α or HD respectively, and then cotreated with TNF?α and HD. All the groups were cultured for 24 hours in vitro, in addition to the untreated control group established for comparison. The ratio of proliferation of VSMCs was determined by non?radioactive MTS/PMS assay and the expression of Syndecan?4  was evaluated by western blot using anti?Syndecan?4  antibody. Results Statistical analysis showed that, compared to the control group, HD alone had no effect on VSMCs growth, but significantly inhibited VSMCs proliferation induced by TNF?α. It also showed that compared to control group, HD alone had no effect on the expression of Syndecan?4， but significantly inhibited the expression induced by TNF?α (P<0.05). Conclusions HD can inhibit proliferation of rat VSMCs and expression of syndean?4 protein induced by TNF?α in vitro.

    Key words:Syndecan?4 ; new houttuyfonate derivative; TNF?α; vascular smooth muscle cells; cell proliferation

     血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖和表型改变是心脑血管动脉粥样硬化和支架内再狭窄的主要病理基础之一,动脉粥样硬化是一个对血管损伤的过度炎症反应。血管损伤后，单核细胞、血小板和淋巴细胞黏附到血管壁，释放一系列细胞因子和肽类生长因子，与特异性受体结合后转导影响VSMCs表型和生长的信号，因此促进了晚期纤维增殖病变的发生。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF?α)是炎症反应的关键调节因子之一,可从多种不同的炎症细胞中释放,在动脉粥样硬化发生中起着关键的作用。Syndecan?4 是硫酸乙酰肝素类的跨膜转运蛋白多糖Syndecans家族的成员之一，主要在血管平滑肌细胞上表达。作为一种与生长因子结合的共受体，它调控着多种细胞生物学效应，在细胞伸展、识别、黏附、迁移和细胞增殖中扮演着重要的角色，同时也介导炎症反应［1, 2］。目前的研究表明，鱼腥草素作为中草药鱼腥草的主要成分，具有一定的抗炎和免疫调节作用［3］。本研究观察了一种新型高效低毒的鱼腥草素衍生物(houttuyfonate derivative, HD)对TNF?α诱导的大鼠VSMCs的增殖及Syndecan?4 表达的影响。

    1  材料和方法

    1.1  主要材料

    6周龄雄性无特殊病原体(specific?pathogen free, SPF)级SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供,合格证号：SCXK(粤)2006?0015。达尔伯克(氏)必需基本培养基(Dulbecco?s minimum essential medium, DMEM)、2.5 g/L胰酶购于Gibco公司。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购于Hyclone公司。HD (结构见图1)由中山大学化学与化学工程学院合成。TNF?α购于Peprotech公司。CellTiter 96 Assay MTS/PMS试剂盒购于Promega公司。目的蛋白一抗为Syndecan?4 兔多克隆抗体H?140，购于Santa Cruz公司(sc?15350)；二抗为抗兔IgG抗体，购于Amersham公司(NA934)。内参一抗为β?Actin鼠单克隆抗体 (C4)，购于Santa Cruz公司(sc?47778)；二抗为抗鼠IgG抗体，购于Amersham公司(NA931)。ECL化学发光试剂盒购于Pierce公司。其余试剂均为国产分析纯。

    1.2  细胞培养

    ［4］方法。选用SPF级SD大鼠断头处死，取胸主动脉中膜以贴块法培养于含10%（φ）FBS的DMEM中，于37 ℃ 5% CO2的孵箱中培养。1周后可见细胞从组织块边缘爬出，2～3周出现致密细胞层，此时即可传代。传代细胞呈典型的“峰谷”状生长。实验所用的VSMCs均为第3～6代传代细胞。

    1.3  细胞增殖评价

    体外培养的VSMCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化，然后在96孔板中以5 000个细胞/孔的密度铺板。8 h后换成无血清的DMEM，无血清条件维持48 h以获得细胞的同步生长停止。48 h后分别加入用含5%FBS的DMEM稀释的TNF?α 20 ng/mL［5］、HD 4 μg/mL、HD 8 μg/mL、TNF?α 20 ng/mL+HD 4μ g/mL、TNF?α 20 ng/mL+HD 8 μg/mL,对照组为含5%FBS的DMEM。24 h后将MTS/PES混合溶液20 mL加入各孔，96孔板在37 ℃ 5％CO2 孵箱中培养90 min，在Bio?Rad 550型酶标仪上以490 nm波长测量吸光度（A）值，细胞的增殖率用吸光度来表示。

    1.4  Syndecan?4 免疫印迹测定

    将体外培养的VSMCs分别用TNF?α 20 ng/mL、HD 4 μg/mL、HD 8 μg/mL、TNF?α 20 ng/mL+HD 4 μg/mL、TNF?α 20 ng/mL+HD 8  μg/mL刺激24 h，对照组为含10％FBS的DMEM。于37 ℃ 5％CO2培养箱内孵育24 h后，倒去培养基并用冰的D?Hanks液洗2次，吸尽液体，按10∶1的比例加入蛋白裂解液，冰上放置10 min。用刮子将细胞刮下，迅速移入离心管中，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清分装至无菌离心管。分别取40 μL于100 ℃沸水中加热5 min，用12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。将已分离的区带用电转移仪转移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜上，室温下用TBS洗3次，每次10 min，然后放入一塑料袋中，加入含5％脱脂奶粉的封闭液，4 ℃过夜。取出PVDF膜，室温下用TBST洗3次，每次10 min，放入一新的塑料袋中，按0.1 mL/cm2加入一抗(1∶200稀释)，室温下于摇床上震荡2 h。取出PVDF膜，室温下用TBST洗3次，每次10 min，放入一新的塑料袋中，再按0.1 mL/cm2加入二抗(1∶10 000稀释)，室温下于摇床上震荡1 h。取出PVDF膜，室温下用TBST洗3次，每次10 min。在暗室内将ECL试剂盒中的试剂1和2按1∶1的比例均匀混合于一玻璃皿中(0.125 mL/cm2)，将PVDF膜浸泡其中约1 min。取出PVDF膜，用ECL Western显影试剂盒采用化学发光法检测蛋白印记条带。实验胶片用光密度扫描仪扫描，结果用图像分析软件Bandscan进行分析。

    1.5  统计学分析

    所有数据资料以±s表示，应用SPSS 13.0软件，采用one?way ANOVA分析，组间比较方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Games?Howell检验，以P<0.05为差异有显著性。

    2  结 果

    2.1  HD对TNF?α诱导的大鼠VSMCs增殖的影响

    结果表明，与对照组比较，TNF?α 20 ng/mL组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.05)，而HD 4 μg/mL、8 μg/mL单独应用对VSMCs的增殖无明显影响(P>0.05)。TNF?α 20 ng/mL+HD 4 μg/mL、TNF?α 20 ng/mL+HD 8 μg/mL与TNF?α 20 ng/mL比较对VSMCs的增殖有显著的抑制作用(P<0.05)，但不存在剂量依赖性(见图2)。

    2.2  HD对TNF?α干预后VSMCs中Syndecan?4 表达的影响

    以目的蛋白对照组灰度值与内参对照组灰度值的比值为1，其余各组Syndecan?4 蛋白表达量分别为：TNF?α 20 ng/mL组1.293±0.053, HD4 μg/mL组0.925±0.135, HD 8 μg/mL组0.877±0.058, TNF?α 20 ng/mL+HD 4 μg/mL组1.031±0.077, TNF?α 20 ng/mL+HD 8 μg/mL组1.017±0.047。统计分析结果表明, 与对照组比较，TNF?α组能显著刺激Syndecan?4 蛋白的表达(P<0.05)，而HD不同剂量组单独应用对Syndecan?4 表达无明显作用(P>0.05)。TNF?α加不同剂量的HD组与TNF?α组比较对VSMCs的Syndecan?4 表达有显著抑制作用(P<0.05) (见图3)。重复5次得到相同的结果。

    3  讨 论

    炎症反应贯穿于动脉粥样硬化的起始、病变进展及斑块破裂、血栓形成的全过程。TNF?α是炎症反应的关键调节因子之一，TNF?α主要由巨噬细胞产生，与正常细胞相比，在动脉粥样硬化病变中其表达上调，在动脉粥样硬化斑块局部的血管平滑肌细胞中发现有TNF?α mRNA表达。VSMCs表面具有TNF?α受体，因此VSMCs既可产生TNF?α，同时本身也是TNF?α作用的靶细胞。TNF?α与VSMCs上的相应受体结合后可以促进细胞的有丝分裂过程。

　　4 表达的影响

    目前研究表明Syndecan?4 在炎症及组织创伤愈合中发挥着重要的作用［6］。Syndecan?4 主要在VSMCs上表达，Syndecan?4 的表达在动脉损伤早期即可增加，随后在7 d内减少到可控制的水平。在内皮组织裸露的动脉，血管中层平滑肌Syndecan?4 的mRNA占整个血管壁的70%～90%。Telci等研究显示，在组织损伤修复中Syndecan?4 可与纤维结合蛋白?转谷氨酰胺酶复合物结合，激活蛋白激酶Cα后，Syndecan?4 聚集并与β1整合素结合，激活细胞存活机制及RGD依赖的细胞黏附，从而导致MAPK途径激活及肌动蛋白应力纤维形成［6］。Syndecan?4 作为一种重要的跨膜蛋白，是信号从细胞表面传导到细胞内部的重要传递者，也是细胞外信号引起细胞增殖反应的重要递呈者［7］。位于细胞表面的Syndecan?4 主要通过激活蛋白激酶Cα参与细胞的信号传导［8］。在细胞因子等致动脉粥样硬化因素的刺激下，Syndecan?4 通过硫酸乙酰肝素链与胞外的配体相结合，并调节其活性，经保守的跨膜区传导进入胞内，在其胞质尾区发生一系列的去磷酸化作用及寡聚化作用，使Syndecan?4 与PIP2的亲和力增强，从而激活了蛋白激酶Cα，进一步激活了ERK1/2 (p44/42 MAPK)，从而启动了大多数促细胞增殖的共同途径ERK途径。

    新近已证明，T细胞(包括Th1细胞、Th2细胞、NK T细胞)介导的免疫调节反应在动脉粥样硬化的发生中扮演着重要的角色［6］。鱼腥草是三白草科植物蕺菜的带根全草，其主要功能包括清热解毒、利尿、消肿、止痛等。药理研究表明，鱼腥草素是鱼腥草中的有效活性成分，抗炎和免疫调节作用是其生物活性的一个重要方面。鱼腥草素可以通过改善T细胞和B细胞的相关功能进行免疫调节［9］。鱼腥草素药效团为β?醛酮结构。迄今为止，国内外对鱼腥草素结构改造主要集中在保留β?醛酮结构不变的情况下，对脂肪链进行改造，如改变碳链的碳原子数，在碳链中引入碳碳双键、碳碳三键等［10-12］。本实验应用的HD借鉴某些具有抗炎活性芳香族醛、酮类化合物的构效特点，以β?醛酮官能团为基础，以β?醛酮与芳香环直接相连的化学结构为主要骨架，在已定的化学结构骨架上，对位引入甲氧基，旨在增强其抗炎及免疫调节作用。前期结果显示，经修饰后，此种HD对革兰氏染色阳性金黄色葡萄球菌的抑菌活性优于鱼腥草素，而杀菌作用也与鱼腥草素相当［13］。根据目前实验结果，推测TNF?α可能是通过与VSMCs表面的相应TNF受体结合，刺激Syndecan?4 的表达增加，随后激活p44/42 MAPK信号传导通路，导致血管平滑肌细胞增殖，而HD可能通过抑制TNF?α诱导的Syndecan?4 的表达，减少蛋白激酶Cα的激活，从而进一步抑制了p44/42 MAPK的磷酸化，最终导致大鼠VSMCs增殖的减少。

    本研究结果提示一定剂量的HD能够显著抑制TNF?α诱导的大鼠VSMCs增殖和Syndecan?4 的表达。因此，将HD作为一种药物先导物，进一步研究其相关潜在作用是非常必要的。

【】
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