益气活血中药对放射性肺损伤大鼠血清及肺组织ET?1表达影响的实验研究

               作者：李凤玉，王炳胜，刘秀芳，张海，石军，葛艳丽

【摘要】  目的 探讨血浆及肺组织中ET?1在放射性肺损伤中的改变及益气活血中药对其作用。方法 96只Wistar种雌性大鼠随机分为照射加中药组（A组）30只、照射加氨溴索组（B组）30只、单纯照射组（C组）30只、正常对照组（D组）6只。用直线加速器对前三组大鼠右肺进行分次照射(5 Gy/次，1次/周，累积剂量为30 Gy)，于照射开始后第4、6、8周3个时间点分别处死三组大鼠各6只，采血测定ET?1浓度，肺组织测定ET?1免疫组化。结果 照射后肺组织炎症和肺水肿进行性加重；C组照射后 5, 15, 30，60 d 血清及肺组织ET?1水平进行性升高,A组、B组各时相值表达相似，均明显低于C组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论 血浆ET?1水平的变化能反映放射性肺损伤的严重程度，益气活血中药能抑制肺组织ET?1的表达,降低血浆ET?1水平，可能是益气活血中药治疗放射性肺损伤的一个作用机制。

【关键词】  放射性肺损伤；内皮素?1；益气活血

　　Abstract： Objective     To explore the changes of endothelin?1 in plasma and lung tissues, and the curative effect of Yiqi Huoxue Recipe (Chinese traditional medicine of nourishing qi and activating blood) in radiation?induced lung injury.Methods     96 wistar rats were randomly divided into irradiation group, irradiation with Yiqi Huoxue Recipe-treated group, irradiation with ambroxol?treated group and normal control group. The first three groups were irradiated at right hemithorax by linear accelerator with a dose of 30 Gy 6 Fraction 5 weeks. Animals were followed up for 26 weeks after the first irradiation. The contents of ET?1 in plasma and lung tissues were measured by ELISA and immunoreactivity repectively at the end of the 4th, 6th, 8th, 12th, and 26th week after the first irradiation. Results     Pulmonary edema and pneumonia aggravated gradually in C group, pulmonary edema and pneumonia of A and B group were lighter than C group, the ET?1 levels in plasma and lung tissues increased rapidly in C group, the ET?1 levels in plasma and lung tissues of A group  were similar to that of B group (P＞0.05), and were both lower than C group (P<0.05).Conclusion     ET?1 could reflect the degree of radiation lung injury. Yiqi Huoxue Recipe could degrade the levels of ET?1 in plasma and lung tissues significantly. This might be one of their mechanisms in treatment of radiation?induced lung injury.

　　Key  words： radiation?induced iung injury; endothelin?1; yiqi huoxue recipe

　　放射性肺损伤是胸部肿瘤放疗、骨髓移植预处理和辐射后的并发症。现已认为内皮素?1 (Endothelin?1，ET?1)作为一种生物活性肽，在特发性肺间质纤维化的发病中有作用[1]，在放射性肺损伤中的作用报道较少。笔者建立了放射性肺损伤模型，以ELISA法检测ET?1在血浆中的变化，免疫组化的方法检测ET?1在肺组织的表达，并观察其在益气活血中药治疗前后的变化，探讨益气活血中药对防治放射性肺损伤的效果。

　　1     材料与方法

　　1.1     动物与试剂     （1）动物来源：健康成年清洁级雌性Wistar大鼠96只，体重180～200 g，由医学院医学实验动物中心提供，供试前在清洁动物房常规饲养3 d，观察无异常者入组实验。（2）实验试剂：ET?1检测试剂盒（R&D公司，美国）。兔抗-内皮素多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供，抗兔IgG由华美生物工程公司提供。

　　1.2     实验方法

　　1.2.1     实验分组     96只大鼠随机分为4组，照射加中药组（A组）30只、照射加氨溴索组（B组）30只、单纯照射组（C组）30只、空白对照组（D组）6只。

　　1.2.2     模型制作     A、B、C三组大鼠均采用6MV?X直线加速器照射右肺，照射前使用戊巴比妥钠0.04 g/kg 腹腔麻醉，俯卧于平台，模拟机下定位，铅块遮挡左肺及纵隔，照射野3 cm×3 cm，总量30 Gy，5 Gy/次，1次/周，照射后等待大鼠苏醒，D组大鼠只麻醉不进行照射。分别于照射开始4、6、8、12、26周末，各组随机抽取6只处死，取其血清及肺组织标本进行相关指标检测。

　　1.2.3     给药方式     取中药黄芪、党参、当归、川芎、地龙、香附等份，水煎、醇沉、浓缩、分装、消毒备用，生药含量2 g/ml，A组每日灌胃1 ml 药物，B组每日氨溴索灌胃50 mg/kg。

　　1.3     检测项目     （1）血清ET?1含量测定：方法按ELISA检测试剂盒说明书进行。（2）病理观察：取大鼠右中下肺浸入100 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，切片 (5 um)，HE染色，显微镜下观察。（3）免疫组化：按说明书操作，阳性为细胞质黄色，棕色和棕黑色，据文献[2]将染色结果分为 0～4级：0级为阴性，1级为灶状阳性，2级为弥漫性弱阳性，3级为弥漫性中等阳性，4级为弥漫性强阳性。每组6张切片，每张切片选2个阳性表达的低倍镜视野。

　　1.4     统计学方法     实验结果以x±s表示。应用SPSS 13.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理。采用单因素方差分析（F检验和q检验）进行各组间比较。P＜0.05为有统计学意义。

　　2     结果

　　2.1     HE染色     D组肺组织结构正常；C组1周肺泡壁增厚，肺毛细血管扩张、充血，少量炎细胞浸润，2周出现局限性炎症浸润灶，4、6周肺水肿明显，局限性肺实变；A组、B组各期炎症、水肿均明显轻于C组。

　　2.2     ET?1血清含量测定     结果见表 1。C组照射后1周ET?1高于D组(P<0.05)，2、4、8周随着病程的延长，放射性肺损伤的加重而逐渐明显升高(P<0.05)，A组、B组各时相值表达相似，均明显低于C组，差异具有统计学意义(P< 0.05)。

　　2.3     ET?1在肺组织中的表达     正常肺组织ET?1在支气管上皮，血管平滑肌及其周围间质，肺泡巨噬细胞和肺上皮细胞有灶状阳性表达。ET?1在肺组织各组的表达，见表2。C组照射后ET?1在支气管上皮、肺上皮细胞、巨噬细胞、炎症细胞处阳性表达细胞数增多，有的连成一片， 表达逐渐增强，血管平滑肌及周围ET?1染色阳性从血管内皮细胞至血管周围，4、8周时表达差异有统计学意义(P<0.05)。益气活血中药及氨溴索4、8周能抑制ET?1表达(P < 0.05)。

　　表1     各组血清ET?1含量（略）

　　与C组比较，①P＜0.05；与D组比较，②P＜0.05

　　表2     各组ET?1在肺组织中的表达 （略）

　　与C组比较，①P＜0.05；与D组比较，②P＜0.05

　　3     讨论
      
　　本研究通过直线加速器复制的大鼠放射性肺炎模型与David等[1]相似，益气活血中药能明显减轻肺水肿及炎症细胞渗出，效果较好。中医学认为，射线是热毒之邪，可损伤人体正气和阴血。从症状上看，急性放射性肺炎属咳、喘范畴，病机为肺热血瘀、气阴两伤、宣肃失司。因此，放射性肺损伤之病机以气虚血瘀为主，治疗以益气活血为主。本实验中黄芪、党参、当归、川芎益气补血活血，地龙清热通络平喘，附以香附理气，促进气血运行。中药药理研究[2～7]黄芪、党参、当归、川芎、地龙、香附具有提高机体免疫力、促进骨髓造血功能、抑制血小板凝集、抗氧化和清除自由基、非特异性抗炎、提高肺表面活性物质等作用；同时地龙能扩张支气管具有解痉平喘作用；香附非特异性抗炎作用强于泼尼松龙，不仅可以取代临床上激素的抗炎抗纤维化作用，又避免了激素的各种不良反应。
      
　　肺是机体ET最重要的合成、代谢及作用的靶器官之一。肺内主要产生ET?1。有研究发现肺纤维化患者血液及尿中ET含量增高，ET?1可以通过增加肺静脉压导致肺毛细血管压升高,引起肺水肿[8～10]。有研究证明ET?1确实有加重和促进肺纤维化的作用[2]。ET?1能提高成纤维细胞的促有丝分裂作用,导致成纤维细胞DNA合成 ,加速细胞的增殖，并促进成纤维细胞合成Ｉ型胶原[11]。一些研究显示ET?1水平与肺纤维化严重程度及临床表现有一定相关性[12]。ET?1的合成增加通过TGF?β、TNF?α、IL?1等细胞因子和缺氧的局部刺激引起ET?1的基因表达和释放，而在放射性肺损伤IL?1、IL?4、PDGF、TGF?β、TNF?α等多种细胞因子产生、释放明显增多[13]。
      
　　本实验结果显示在照射后1周血清中的ET?1开始升高并且随着放射性肺损伤的加重，血清ET?1升高更明显，提示ET?1水平可能反映放射性肺损伤的严重程度。益气活血中药、氨溴索能降低照射2、4、8周时血浆的ET?1。在支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞、浆细胞和Clara细胞都有特异性ET存在。正常大鼠肺组织ET样免疫物质极少。ET?1在博莱霉素诱发的肺纤维化免疫组化显示免疫反应性显著增高[11]。在本实验条件下，随着照射后病程的， ET?1在肺组织表达逐渐增强，且放射性肺损伤越重，肺组织表达越强。益气活血中药能明显抑制ET?1的表达。综上所述，益气活血中药能抑制肺组织ET?1的表达，降低血浆ET?1水平，其作用较地塞米松强，可能是益气活血中药治疗放射性损伤的一个重要的环节之一。其作用机制还有待进一步研究。

【】
  　　[ 1] David P, Deitmar WS, Philip R, et al. Morphological correlates of fractionated radiation of the mouse lung: early and late effects[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1994, 29: 789-804.

　　[ 2] Anscher MS,Marks LB,Shafman TD,et al.Using plasma transforming growth factor beta?1 during radiotherapy to select patients for dose escalation[J]. J Clin Oncol, 2001, 19(11): 3758.

　　[ 3] 木海鸥, 苏孝共. 地龙的药理研究概要[J]. 药业, 2007, 16(1): 61-62.

　　[ 4] 黄险峰, 彭国平. 香附的化学成分及药理研究进展[J]. 中药材, 2003, 26(1): 65-68.

　　[ 5] 李 庆. 黄芪的药理药效研究进展[J]. 医药产业资讯, 2006, 4(3): 128-129.

　　[ 6] 夏 泉, 张 平, 李绍平, 等. 当归的药理作用研究进展[J]. 时珍国医国药, 2004, 15(3): 164-165.

　　[ 7] 付成国, 文连奎, 董 然.轮叶党参化学成分与药理作用研究进展[J]. 中药材, 2007, 30(4): 497-499.

　　[ 8] Uguccioni M, Pulsatelli L, Grigolo B, et al. Endothelin linidopathic pulmonary fibrosis[J]. J Clin Pathol, 1995, 48: 330-334.

　　[ 9] Vancheeswaran R, Magoulas T, Efrat G, et al. Circulatin gend othelin?1 levels in systemic sclerosis subsets a marker of fibrosis or vascular dysfunction[J]. J Rheumatol, 1994, 21: 1838-1844.

　　[10] Sofia M, Mormile M, Farone S, et al. Endothelin?1 excretion in urine in active pulmonary sarcoidis and in other interstitial lung diseases[J]. Sarcoidosis, 1995, 12: 118-123.

　　[11] Rizvi MA, Katwa L, Spsdone DP, et al. The effect of ad endotelin lon collagen type Ⅰ and type Ⅲ synthesis in cultured porcine coronary artery vascular smooth muscle cells[J]. J Mol Cell Cardiol, 1996, 28: 243，252.

　　[12] 李伟杰. 内皮素与肺纤维化[J]. 医学综述, 1999, 5: 401-402.

　　[13] Rublin P, Johnston CJ, Williams JP, et al. A perpetual cascade of cytokines post irradiation leads to pulmonary fibrosis[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1995, 33: 99-109.