人精子扫描电镜样品的制备与观察
作者：孔祥林, 刘鲜林, 常傲霜
【关键词】 精子； 显微镜检查，，扫描； 超微结构
扫描电镜在临床医学、基础医学等领域具有广泛的应用价值，尤其在白血病、红细胞病变、细胞凋亡等游离细胞的临床诊断及基础研究方面得到了广泛的应用［1］。随着计划生育和优生优育工作的开展，对人精子的超微结构研究受到了广泛重视。由于人精子含水量大，表面导电性差，因此是扫描电镜样品制备和观察的难点。为了使其适应扫描电镜观察的要求，并更好地显露其表面的形态结构，在制样过程中需要对其进行清洗、脱水。由于水的表面张力为72.75 dyn/cm，样品极易受到脱水张力的损伤，发生收缩和变形［2］。同时在扫描电镜下观察时，由于其二次电子的产率低，样品密度低，电子束容易穿透；而样品脆弱，又经不起电子束长时间的照射。因此，要想取得质量较好的图像，正确调整扫描电镜工作时的参数也非常重要。我们通过反复对不孕症患者精液样品的制备和观察，出一套较好的制样方法，并选择适合的加速电压，取得质量较好的图像。
1 材料和方法
1.1 仪器
漩涡混合器，普通离心机，普通冰箱，JEM JEE-5B真空冷冻干燥机，HITCH E-1010离子溅射仪，HITCHI S-3400N扫描电镜。
1.2 样品制备
24 h内（4 ℃冷藏）送样（10 ml试管）的精液，漩涡混合器摇匀（1～2 min）。采用离心清洗法：用吸管吸取样品1 ml，加5 ml PBS（或生理盐水）离心清洗（2 500～3 000 r/min，5 min） 3次，注意：去上清液时宜缓慢倒出，每次管底留液应不少于0.5 ml［3］。加3%～4%戌二醛固定30 min，PBS离心清洗2次，清洗方法同前。然后分别用50%、70%、90%、100%乙醇作梯度脱水，每次15 min，离心3 000 r/min，5 min。在常温、常压下（也可在冷冻条件下）用100%的醋酸异戌酯置换乙醇，时间30 min,然后3 000 r/min，离心5 min，去除上清液（可见管底有白色絮状物），用吸管吸管底液2～3滴滴到载璃片上，干燥（也可采用JEE-5B真空冷冻干燥机干燥），用玻璃刀切下含有样品的部位，大小2 cm×2 cm。粘样后进行表面导电处理：HITCH E-1010离子溅射仪喷金，时间80 s，电流15 mA，真空7～10 Pa。
1.3 精液样品的观察
电镜参数设置：图像模式为SE，束流（Emission）70 nA ，工作距（WD）20 mm/30 mm，样品台倾斜（T）400，物镜光栏（AP）2～3号，亮度对比度为自动， 焦距为自动加手动，物镜消像散（OS）为手动。扫描电镜观察设两组不同的加速电压-放大倍率条件，第1组：10 kV、20 kV、30 kV×10 000倍；第2组：12 kV×10 000倍、×15 000倍、×20 000倍。
2 结果
10 kV加速电压的图像质量较好，图像显得比较自然，背景噪音较小（图1）。20 kV加速电压的图像显得生硬，表面粗糙，样品及背景有雪花点噪音，样品边缘出现变亮的放电现象（图2）；30 kV图像焦距不清，无法通过调焦得到理想的图像（图3）。第2组观察条件中， 12 kV×10 000倍×15 000倍图像较好（图4、图5）。12 kV× 20 000倍以后，聚焦开始变差，样品表面已感模糊，样品表面可观察的细节，并没有随图像的放大而有更多的细节显露（图6）。
3 讨论
精液样品制作与液体细胞培养、血液、组织渗图1 10 kV加速电压的图像（10 000倍） 出液、感染脓液、咯血、呕血、痰液、脑脊液、胸腹水等类似，必须先清洗后固定。因为清洗掉样品表面的杂物，有利于充分显露样品表面的细节和减少观察时的干扰。乙醇的表面张力为22 dyn/cm，对生物样品的损伤较小是比较合适的固定剂［2］。采用乙醇梯度脱水再用醋酸异戌酯置换乙醇，是本样品处理方法的关键。在清洗和固定过程中，离心是主要的分离手段，其中把握好离心速度和离心时间十分重要。因为，离心力过大样品中该清除的粘液、杂质会沉入管底，达不到清洗的目的；离心力过小去除上清液时样品会丢失过多，给电镜观察带来困难。经多次实验观察，2 500～3 000 r/min离心5 min较适合该样品的清洗。
电镜观察中，锁定了束流和工作距离等可以调整的参数，以加速电压和放大倍率作为观察条件指标，设置了：10 kV、20 kV、30 kV×10 000倍；12 kV×10 000倍、×15 000倍、×20 000倍两组观察方法。观察发现，按上述方法制成的样品，扫描电镜的图像质量较好，样品表面比较干净，轮廓显露完整、形貌清晰，损伤、变形较小，表面有细节可见。经倾斜样品台400观察，图像立体感强，样品的相互关系清晰易于判断。
由于二次主要是来自样品10 nm的浅层，反映样品的表面形貌衬度［4］。25 kV、30 kV加速电压过高，入射电子束进入样品过深，击发出的二次电子不易逸出样品，二次电子的产率反而减少，图像的清晰度变差。可见，加速电压的高低，对医学、生物样品的图像质量，也会产生较为明显的影响。通过比较认为10 kV加速电压比较合适，因为其产生的二次电子像质量较为理想。扫描电镜的放大倍率实际上是样品被扫区与屏幕尺寸的大小之比［5］。由于扫描电镜采像尺寸是固定的（非数字放大），所以它们有如下关系：放大倍率1 000倍、5 000倍、10 000倍、100 000倍，电子束扫描样品的宽度分别为125、25、12、0.125 μm。因此，高倍率下（＞10 000倍）想要看到样品表面的细节取决于：一是样品表面有＜0.125 μm起伏的结构，经实测精子头部的大约尺寸为2.5 μm×5 μm，也就是说至少在2.5 μm×5 μm的尺寸中要有＜0.125 μm起伏的结构；二是要尽可能提高样品表面二次电子的产率。生物膜的主要成份是脂类、蛋白、糖类，导电性差，可以采取物理（喷金）、化学染色（柠檬酸铅）的方法来改善［2］；三是扫描电镜要有较高的分辨率。生物样品表面形貌和它们的结构是不能改变的，但是，可以通过不断改进制样方法，调整扫描电镜的参数来改善观察效果，使常规制样不能显露的细节得以显示。
HITCHI S-3400N虽为普通扫描电镜，其分辨率的理论指标仅为3 nm，加上多种因素的影响，观察时没有达到最好的状态，但对于头部直径为5 μm的精子来说，仍显得游刃有余。图像在20 000倍后开始模糊，样品表面结构不能更好的被显露，说明制样方法还有待于改进和提高。
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［1］杨勇骥.实用生物医学电子显微镜技术［M］.上海：第二军医大学出版社,2003.1 .
［2］凌诒萍,俞章.细胞超微结构与电镜技术［M］.上海：复旦大学出版社,2004.2.
［3］王仲涛.组织和细胞扫描电镜图谱［M］.北京：人民卫生出版社,1986.5.
［4］程时,彭学敏.生物医学电子显微镜技术［M］.北京：北京医科大学、协和医科大学联合出版社,1997.7.
［5］付洪兰.实用电子显微镜技术［M］.北京：高等出版社，2004.7.
