高效液相色谱法测定大黄中的大黄素、大黄酚的含量
【关键词】 高效
摘要：采用高效液相色谱法中的梯度洗脱测定大黄中的大黄素、大黄酚的含量。结果显示，所测得的二组分的含量和相对标准偏差分别为0.1189%、2.3%；0.4213、3.1% ，提示该法操作简单，结果可靠，与药典法没有显著性差异。
关键词：高效液相色谱法；梯度洗脱；大黄素；大黄酚
大黄是我国临床常用的中药之一，素有“将军”之称，在中药复方中应用相当广泛，有“泻热通畅、凉血解毒、逐瘀通经、攻积导滞、利胆退黄”之功效，《神农本草经》称大黄“主下瘀血、血闭、寒热、破症瘕积聚、留饮、宿食、荡涤肠胃、通利水谷、调中化食、安和五藏”。人们对大黄的研究日益加深，相继发现了新的活性成分。大黄中的有效成分有蒽醌类、芪类、苯丁酮类、鞣质类、色原酮类、萘类、有机酸、糖、蛋白质、甾醇等150多种成分。大量的研究表明，大黄的诸多制剂均以保存总蒽醌为目的。本研究采用高效液相色谱法中的梯度洗脱直接测定经甲醇简单提取后的样品中的大黄酚和大黄素的含量，结果可靠。
1 仪器与试剂
11 仪器
HP1100型高效液相色谱仪(美国惠普公司)，包括四元泵、真空脱气机、柱温箱、紫外检测器。色谱柱: Hypersil ODS 4.6m×50mm.5μm；预柱:C18(4.6×50mm)5μm)（大连依利特公司）。
12 试剂
大黄素、大黄酚对照品购自药品生物制品检定所；大黄生药材为市售（产地为甘肃、四川）；乙腈为色谱纯，其余为分析纯。
2 方法与结果
21 色谱条件
0.04M NH4OAC水溶液（PH=2.8）：乙腈=A:B；梯度洗脱：0分钟A:B=71:29，12分钟A:B=21:79，14分钟A:B=21:79，15分钟A:B=71:29。检测器：紫外检测器；波长：436nm；流速：1.0ml/min；进样体积：10μl；柱温箱温度：25℃。
22 标准曲线的绘制
精密称取大黄素、大黄酚对照品各0.0020g分别置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即为大黄酚和大黄素的标准贮备液，浓度为2mg/ml。以标准贮备液为基础，以甲醇为溶剂准确配制浓度为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/ml系列浓度。精取10μl注入液相色谱仪中以对照品峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，其回归方程为：C大黄素=7.0632×10-7A＋0.00094，r=0.9997，C大黄酚=10.672×10-7A＋0.00156， r=0.9998。
在本研究色谱条件下，当信噪比为3时测得大黄素和大黄酚的最低检出浓度为0.15μg/ml和0.23μg/ml。
23 精密度试验
取样品测定项下配制的供试品溶液在一日内不同时间0、2、4、8、12小时内进行HPLC分析测得日内精密度和连续7日内进行HPLC分析测得日间精密度。结果大黄素和大黄酚在日内RSD分别为2.3%和2.5%；日间RSD分别为2.5%和1.9%。见表1、2。表1 日内精密度（略）
24 加样回收率试验
取已知含量的大黄生药材0.5g，分别加入对照品溶液适量，按样品测定方法进行测定。连续测得5次测得平均回收率分别为大黄素98.1%(RSD 2.9%)、大黄酚100.7%(RSD 2.5%)，结果见表3、4。表3 大黄素加样回收率结果（略）表4 大黄酚加样回收率结果（略）
3 样品的测定
将样品研成细粉，准确称取0.5g左右，置碘量瓶中加入甲醇30ml，超声提取30分钟，提取物过滤，溶剂减压蒸干，残渣用5ml甲醇溶解，经微孔滤膜过滤后取10μl注入HPLC中，带入回归方程，用外标法测定含量。同时，按药典（2000版）附录IXH水分测定法测定含水量。
将样品按样品测定项下规定进行测定，同时按药典法（2000年版药典一部第18页）进行测定，结果见表5。表5 HPLC法与药典法测定结果（略）
4 讨论
41 药材含量测定中提取剂的确定
在样品的预处理过程中，采用正交设计法对甲醇、乙醇等溶剂进行考察，确定单组分甲醇为提取剂，同时对提取的时间和方法进行考察，确定为超声波提取30分钟。
42 HPLC法中检测波长的确定
本研究考察了大黄素和大黄酚的紫外图谱发现在436nm处用梯度洗脱法分离样品，样品的分离度和检测限均比较好，因此检测波长定为436nm。
43 HPLC法中线形范围的确定
本法的线形范围是0.5μg ~2.5μg，这个线形范围是了大量的和本法的最低检测限确定的。
大黄素和大黄酚属弱酸性成分，流动相呈弱酸性条件下其保留行为得到改善，本研究考察了以0.04M NH4OAC(pH=2.8)和乙腈为流动相,分离得到的峰形对称,分离效果良好。
实验结果表明，本法结果可靠，与药典法没有显著性差异，其最大的优点是操作简单准确。
参考文献
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