四种甘草对人乳腺癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的比较研究
【摘要】 目的比较新疆四种野生甘草活性成分对人乳腺癌细胞的增殖抑制作用，以期筛选出药效最佳的甘草种类。方法采用MTT法检测不同样品对BCAP?37细胞的增殖抑制作用，Hoechst33258荧光染色法检测各样品诱导BCAP?37细胞凋亡的作用。结果4种甘草的活性成分对人乳腺癌BCAP?37细胞具有显著的增殖抑制与诱导凋亡的作用，且存在显著的种间与产地间差异。结论抗癌药效最佳的甘草种类为阿拉尔甘草。
【关键词】 甘草 活性成分 人乳腺癌BCAP 37细胞
Comparative Study on the Anti-proliferation and Apoptosis-inducing Effects of Active Components from Four Glycyrrhiza Species on Human Breast Cancer BCAP-37 Cell
Abstract:ObjectiveTo select the optimal glycyrrhiza species for medicinal utilization by comparing the anti-proliferation and apoptosis-inducing effects of active components from four wild glycyrrhiza species in Xinjiang on human breast cancer BCAP?37 cell. MethodsThe anti-proliferation effects of different samples on BCAP?37 cell were measured by MTT assay. The cell apoptotic rate was detected by Hoechst 33258 stain.ResultsActive components of four Glycyrrhiza species inhibited the proliferation of BCAP?37 cells and induced apoptosis significantly. What's more, there were significant interspecific and spatial variations in the anti-proliferation and apoptosis-inducing effects. ConclusionThe optimal Glycyrrhiza species for anticancer utilization is Glycyrrhiza alalensis L.
Key words:Glycyrrhiza; Active Component; Human breast cancer BCAP?37 Cell
甘草是我国十分重要的中药材，素有“十方九草”的美誉。近年来，随着对甘草开发利用的不断深入，甘草被广泛用于药品、食品、保健品、化妆品等领域［1］，甘草的市场需求量剧增。我国是世界上甘草出口大国，其中80％为野生甘草，仅有20％为栽培甘草。我国甘草储量锐减，由建国初期200～250万吨下降到50～70万吨［2］。现存的野生甘草资源已无法满足日益增长的市场需求，因此，人工栽培甘草势在必行，野生优质甘草品种的筛选显得尤为紧迫。甘草的品质高低最终要以其药效来衡量，前人仅以活性成分含量为指标对甘草品质进行的研究是片面的［3～7］。
甘草中最重要的两大类活性成分甘草酸类和甘草黄酮类化合物均具有抗炎、抗病毒及抗肿瘤之功效 ［8,9］，甘草的抗肿瘤活性尤其受到国内外学者的关注。乳腺癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤。新近报告，美国女性乳腺癌的发病率已跃升为1/7，而在我国过去10年中，乳腺癌发病率也上升了27%，乳腺癌业已成为威胁妇女生命和健康的头号杀手［10］。因此，本文研究了新疆的胀果甘草Glycyrrhiza inflata Batal.，光果甘草G. glabra L.，阿拉尔甘草G. alalensis L.和黄甘草G. eurycarpa L.等4种野生甘草的甘草水提物和甘草总黄酮对人乳腺癌BCAP?37细胞的增殖抑制作用，以期筛选出药效最佳的甘草栽培种类，为优质甘草的规模化人工种植奠定基础，为甘草抗癌新药物的研发提供依据。
1 器材
1.1 细胞株人乳腺癌BCAP?37细胞株由科学院上海细胞生物学研究所细胞库提供。
1.2 实验样品各样品采样地点及样品名称见表1。所有样品经石河子大学李学禹先生鉴定为真品。表1 采样地点及样品名称（略）
1.3 试剂与仪器
1.3.1 试剂RPMI1640培养基,Gibco公司；小牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司；HEPES，华美生物工程公司；胰蛋白酶，上海蓝季科技有限公司；四噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO), Sigma公司；顺铂(DDP)，江苏豪森药业股份有限公司；Hoechst33258染色试剂盒，碧云天生物技术研究所。
1.3.2 仪器CO2 培养箱，美国（Forma）；Metertech ∑960自动酶标仪；荧光显微镜，OlympusBX51；超净工作台，上海净化设备厂；血球记数板，上海医用光学仪器厂。
2 方法
2.1 实验样品采集与处理采集株龄一致(根茎粗细相等)的4种甘草的根茎材料，立即放入80 ℃烘箱中烘干至恒重，然后用药材粉碎机将其粉碎成粉末，过100目筛，备用。
2.2 甘草活性成分的制备
2.2.1 甘草水提物准确称取1.0 g甘草根茎干粉加10 ml蒸馏水于室温下放置48 h，12 000 r/min离心10 min，?0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，加样前用细胞培养液根据［11］将不同样品配制成含甘草酸为1 200 μg/ml的受试样品。
2.2.2 甘草总黄酮准确称取1.0 g甘草根茎粉末，用250 ml无水乙醇加5滴浓盐酸溶液为提取剂在索氏提取器中于95℃的水浴加热条件下提取6 h，浓缩至30 ml，?0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，加样前用细胞培养液根据文献［11］将不同样品配制成含总黄酮为50 μg/ml的受试样品。
2.3 细胞培养BCAP-37细胞用含10％灭活小牛血清的RPMI1640培养基，加入NaHCO3 2 g/L，谷氨酰胺0.24 g/L，Hepes 2.4 g/L，青霉素100 U/ml，链霉素100 mg/ml，置于37℃, 5％ CO2孵箱中培养。实验用细胞均处于对数生长期，常规台酚蓝计数活细胞大于95％。
2.4 细胞增殖抑制实验(MTT法)将处于对数生长期的BCAP?37细胞用胰蛋白酶消化后, 制成2.0×105个/ml的细胞悬液,然后以每孔100 μl接种到96孔板上, 在37℃，5% CO2孵箱中培养24 h后更换培养液，实验组加入不同的受试样品100 μl，终浓度分别为：甘草水提物中甘草酸浓度为600 μg/ml，甘草总黄酮25 μg/ml，每一样品均设8个平行孔，阳性对照组加入顺铂100 μl：终浓度50 μg/ml，空白对照组加入等体积的培养液。继续培养24 h,48 h及72 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(浓度为5 mg/ml)，轻振培养板，放回培养箱内再孵育4 h后，吸尽上清液，每孔中加二甲基亚砜150 μl，振荡器上振荡10 min, 用酶标仪检测各孔吸光度（OD值）测定波长λ=570 nm。抑制率公式为：抑制率(％)=〔(对照组OD值－实验组OD值)/对照组OD值〕×100％。
2.5 细胞凋亡率实验取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡20 min，0.9%NaCl溶液洗涤3次，再用细胞培养液洗涤1次。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞，培养过夜，使约为50%～80%满。加入甘草水提物和甘草总黄酮，继续培养48 h，吸尽培养液，加入0.5 ml固定液，固定10 min。去固定液，用0.9%NaCl洗两次，3 min/次，吸尽液体,洗涤时用摇床。加入0.5 ml Hoechst33258染色液，染色5 min,也用摇床。用0.9%NaCl洗两次，3 min/次。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。荧光显微镜下（Ex350nm，Em460nm）随机选取5个视野拍照后计数其凋亡细胞与正常细胞，凋亡率＝〔凋亡细胞/（凋亡细胞＋正常细胞）〕×100％。
2.6 统计学处理实验所得所有数据均经SPSS12.0 软件处理并对处理组间进行单因素方差分析，P<0.05时表示存在显著性差异。
3 结果
甘草活性成分对BCAP?37细胞的增殖抑制率（％）结果见表2。经Hoechst33258荧光染色，正常细胞核呈弥散均匀荧光，凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染（图1～3）。甘草活性成分诱导BCAP?37细胞凋亡的实验结果见表3。表2 甘草活性成分对BCAP?37细胞的增殖抑制率(略)表3 甘草活性成分诱导BCAP?37细胞凋亡的作用（略）
4 讨论
4.1 甘草活性成分对BCAP?37细胞具有良好的增殖抑制作用，且存在最佳处理时间细胞抑制率结果表明，与阳性对照顺铂处理组相比较，甘草活性成分处理48 h和处理72 h对BCAP?37细胞都具有良好的抑制作用。阳性对照顺铂随着作用时间的增长抑制率显著升高，表现为明显的时效关系，而甘草活性成分对BCAP?37细胞的抑制作用式样则不同，甘草水提物：与处理24 h相比，处理48 h的所有样品对细胞的抑制率显著升高，而当处理时间增长至72 h时，仅阿拉尔甘草的抑制率继续升高，53团光果甘草和阿拉尔市胀果甘草则与处理48 h无显著差异，其余三个样品的抑制作用均显著降低；甘草总黄酮：处理48 h的所有总黄酮样品对细胞的抑制率比处理24 h亦明显上升，而对细胞处理72 h，仅阿拉尔市胀果甘草和焉耆县黄甘草与处理48 h无显著变化，其余样品的抑制作用均显著降低。因此，甘草活性成分对BCAP?37细胞的最佳抑制作用时间为48 h。
4.2 甘草活性成分对BCAP?37细胞的抑制作用存在显著的种间与产地间差异由甘草水提物对细胞处理48 h的结果可得，阿拉尔市阿拉尔甘草的抑制率最高，其次为阿拉尔市光果甘草与阿拉尔市胀果甘草，焉耆县黄甘草、焉耆县胀果甘草与53团光果甘草最低；由甘草总黄酮对细胞处理48 h的结果可得，阿拉尔市光果甘草与阿拉尔市阿拉尔甘草的抑制作用最强，53团光果甘草与阿拉尔市胀果甘草次之，焉耆县胀果甘草与焉耆县黄甘草最弱。
不同产地的同种甘草对BCAP?37细胞抑制作用均表现为，阿拉尔市光果甘草明显高于53团光果甘草，阿拉尔市胀果甘草显著高于焉耆县胀果甘草。
实验所有受试样品在活性成分浓度相同（甘草水提物中甘草酸浓度均为600 μg/ml，甘草总黄酮浓度均为25 μg/ml）的条件下对BCAP?37细胞的增殖抑制与诱导其凋亡的作用存在显著的种间和产地间差异，这表明甘草的抗癌活性高低并不与甘草酸和甘草总黄酮的含量呈正相关，而很可能与其中抗癌活性较强的其他酸类化合物和某些黄酮单体有关。因此，前人仅以活性成分含量为指标进行的甘草品质研究是值得商榷的。
4.3 甘草活性成分能有效抑制BCAP?37细胞的增殖与其诱导BCAP?37细胞凋亡存在相关性与抑制细胞增殖的结果相比，不同样品的甘草活性成分诱导细胞凋亡的差异基本一致，甘草水提物中诱导BCAP?37细胞凋亡作用最强的为阿拉尔市胀果甘草与阿拉尔市阿拉尔甘草，甘草总黄酮中诱导BCAP?37细胞凋亡效果最佳的为阿拉尔市光果甘草与阿拉尔市阿拉尔甘草。因此，甘草活性成分诱导BCAP?37细胞凋亡是其显著抑制BCAP?37细胞增殖的重要途径。
4.4 阿拉尔甘草和黄甘草亦为很好的药用甘草资源据2000年版《药典》记载，只有胀果甘草、乌拉甘草和光果甘草等3种甘草被列为药用甘草［12］。本实验的研究结果表明，阿拉尔市阿拉尔甘草对BCAP?37细胞的增殖抑制作用与诱导凋亡作用均最佳；虽然焉耆县黄甘草对BCAP?37细胞的增殖抑制率最低，但是其水提物和总黄酮对BCAP?37细胞的凋亡诱导作用均明显高于阳性对照顺铂处理组。因此，阿拉尔甘草和黄甘草同样具有良好的药用价值。
总之，4种甘草的活性成分甘草水提物与甘草总黄酮对人乳腺癌BCAP?37细胞具有显著的增殖抑制与诱导凋亡的作用，且存在显著的种间与产地间差异。本研究的结果对于甘草资源的合理利用与甘草抗癌新药物的研发具有重要的理论意义和实际应用价值。建议用于规模化人工栽培的甘草物种当首选抗癌活性最佳的阿拉尔市阿拉尔甘草，其次为阿拉尔市光果甘草与阿拉尔市胀果甘草，同时要重视对焉耆县黄甘草的开发与利用；在甘草酸类与甘草黄酮类成分进行甘草抗癌新药物筛选时，应优先考虑甘草黄酮类成分。
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