高效液相色谱法测定红果小檗不同部位小檗碱含量

            作者：库尔班江,努尔买买提,罗新泽,海如拉

【摘要】  目的：建立红果小檗中小檗碱的含量测定方法。方法：高效液相色谱法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，迪马Diamonsil?C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈?0.1%磷酸(50∶50，每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g)；检测波长：265 nm；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。结果：线性关系:Y=4009.20X+53.735(R=0.9998)，线性范围0.027 μg-1.354 μg；回收率：平均回收率为99.43%，RSD=1.12%(n=6)。结论：本法操作简便准确，具有分离度和重现性好、灵敏度高的特点，可作为该药材中小檗碱的含量测定和质量监控方法。

【关键词】  红果小檗；盐酸小檗碱；色谱法，高压液相

   　　红果小檗(Berberis nummularia Bge.)系小檗科(Berberidaceae)小檗属(Berberis L.)植物［1?2］，是主要分布在伊犁河流域一带的药食兼用植物品种之一，具有清热燥湿、泻火解毒、止泻及滋补肝肾等功效，维吾尔医常用于急性胃肠炎、痢疾、咳嗽、肝炎、高血压、消化不良、肾虚滑精及白带等症的［3?4］。红果小檗的其它同属植物均可列为重要药材，又是提取小檗碱的重要原料［5?6］。关于红果小檗中化学成分的研究已有报道［7］，但在其中有效成分的含量测定方面尚未见报道。笔者采用高效液相色谱法测定了红果小檗不同部位小檗碱的含量，为质量评价提供了依据和方法。

    1  实验材料

    1.1  仪器  Agilent1100型高效液相色谱仪，G1311A系列四元梯度泵，G1322A脱气机，手动进样器，G1314A VWD可变波长紫外检测器，HP Rev. A. 0501化学工作站(Agilent公司)，Shimazhu LibrorAEL?40SM型天平(日本岛津)，SB 5200 超声清洗器(上海Branson 公司)。

    1.2  试药与试剂  盐酸小檗碱对照品(批号为110713?200208，药品生物制品检定所提供)；红果小檗［2006年8月采自伊宁县阿肉斯坦乡，并通过中国院新疆分院阿吉教授检定为小檗科(Berberidaceae)小檗属(Berberis L.)植物红果小檗(Berberis nummularia Bge.)］。

    2  实验方法

    2.1  色谱条件  色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，迪马Diamonsil?C18色谱柱(4.6　mm×250　mm，5　μm)；流动相：乙腈－0.1%磷酸(50∶50，每100　mL加十二烷基磺酸钠0.1 g)；检测波长：265 nm；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。理论板数按盐酸小檗碱峰应不低于4000，见图1，图2。

    图1  盐酸小檗碱对照品HPLC图图2  供试品HPLC图

    2.2  对照品溶液的制备  精密称取盐酸小檗碱对照品4.23 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。从中精密吸取2 mL试液，置于25 mL量瓶中，流动相稀释至刻度，制成盐酸小檗碱浓度为13.54 μg/mL的对照品标准溶液。

    2.3  线性关系  精密吸取上述盐酸小檗碱对照品溶液2 μL，6 μL，8 μL，10 μL，20 μL，30 μL，50 μL，100 μL进样，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以进样进样量为横坐标，主峰峰面积为纵坐标进行线性回归，其回归方程为：Y=4009.20X+53.735(r=0.9998)，线性范围为0.027 μg-1.354 μg，见表1。表1  盐酸小檗碱的线性考察结果

    实验号12345678进样量(μg)0.0270.08120.1080.1350.2710.4060.6771.354峰面积142.403363.948477.063590.1521164.2441728.0702757.9055470.9422.4  供试品溶液的制备  取试样红果小檗的根、茎、叶及果实粉末各1 g，精密称定，分别置于10 mL锥形瓶中，加盐酸?甲醇(1：100)混合溶液适量，超声30 min，室温放至，用盐酸?甲醇(1：100)混合溶液稀释至刻度，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，作为供试品溶液。

    2.5  精密度与重复性试验  精密吸取对照品溶液(13.54　μg/mL)10　μL，连续进样5次，测得盐酸小檗碱峰峰面积积分值分别为544.785、565.273、558.285、564.317、549.827，平均值为556.497，RSD=1.32%(n=5)。

    2.6  稳定性试验  取同批供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、12 h、24 h向色谱仪进样10 μL，测得峰面积分别为1238.573、1245.580、1242.535、1248.245、1258.655，平均值为1246.718，RSD=0.43%(n=5)。表明供试品至少在24 h内稳定。

    2.7  重现性试验  取同一批样品6份，每份约0.1 g，按2.4项下方法制备并按上述条件测定，结果盐酸小檗碱平均含量为7.68‰，RSD=1.26%(n=6)。

    2.8  加样回收率试验  称取已知含量的取同一批供试品6份，每份约0.5 g，精密称定，分别加入一定量盐酸小檗碱对照品，按样品测定项下方法制备供试品溶液并测定含量，计算回收率，结果平均回收率为99.43%，RSD=1.12％(n=6),见表2。表2  加样回收率试验结果

　　22.9  样品含量测定  分别精密吸取样品各部位供试品溶液与对照品溶液各进样10 μL，测定，按2.1项下法检测，以外标法计算干样品中盐酸小檗碱的含量，结果见表3。表3  红果小檗不同部位小檗碱含量测定结果

   3  结果与分析

    3.1  样品经不同溶剂和方法提取摸索，结果以盐酸?甲醇(1：100)混合溶剂超声提取30 min时，盐酸小檗碱提取完全，测定时含量最高，因此本实验采用该方法提取。

    3.2  盐酸小檗碱对照品溶液在本流动相中265　nm处有最大吸收峰，在265　nm处其他组成成分不影响，故本实验选择265　nm为测定波长。

    3.3  本实验利用了十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，迪马Diamonsil?C18色谱柱，流动相比例调整为乙腈－0.1%磷酸(50∶50，每100　mL加十二烷基磺酸钠0.1　g)时，样品中的主要成分盐酸小檗碱得到了有效分离，保留时间明显缩短，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算大于4000，取得理想的分离效果。

    3.4  HPLC法测定红果小檗的根、茎、叶及果实中小檗碱的含量，结果表明小檗碱主要集中在其根部。该方法具有分离度和重现性好、灵敏度高的特点，适用于该药材中小檗碱的含量测定，为民族药的发掘和整理以及质量监控提供了方法和依据。

【】
  ［1］米吉提,徐建国.新疆植物检索表［M］.乌鲁木齐：新疆大学出版社,2000:155?157.

［2］新疆植物志编辑委会.新疆植物志［M］.乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1995:4.

［3］孙 华,王 丽,阿不都拉.小檗色素的提取及其理化性质的研究［J］.生物科技通讯,2005,16(4):405?406.

［4］马木提.库尔班.新疆小檗中黄色色素的提取及其理化检验［J］.食品科技,2002,5:42?43.

［5］于俊林,杨文娣.小檗碱的植物资源［J］.中草药,2005,36(9):1434?1436.

［6］高文义,李瑞丽.HPLC法测定关黄柏中盐酸小檗碱的含量［J］.吉林中医药,2006,26(9):73.

［7］库尔班江,海如拉,贾娜尔,等.红果小檗中小檗碱的薄层鉴别［J］.伊犁师范学院学报,2003，3：101.