加味四逆散治疗肝纤维化量效关系实验研究

          作者：郑旭锐，孙守才，李长秦

【摘要】  目的：观察加味四逆散不同剂量与疗效的关系，探讨该方抗肝纤维化的合适用量。方法：采用二甲基亚硝胺腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型，加味四逆散大、中、小不同剂量灌胃给药，免疫组织化学方法检测分析各组大鼠肝组织Ⅳ型胶原的含量。结果：加味四逆散中剂量影响效果优于小剂量和大剂量，3组之间的疗效呈中剂量＞小剂量＞大剂量的关系，中剂量与小、大剂量比较有显著性差异(P＜0.05)，而小剂量与大剂量比较无显著性差异(P＞0.05)。结论：加味四逆散对肝纤维化有肯定的作用，而且中剂量疗效较好。

【关键词】  四逆散/治疗应用；肝硬化/病；大鼠

    1  实验材料

    1.1  实验动物  雄性SD大鼠66只，体重(180±20)g，由第四军医大学实验动物中心提供。

    1.2  药物及试剂  加味四逆散由柴胡、枳壳、白芍、甘草、黄芪、丹参、桃仁等药组成(购自陕西中医学院附属药房，经本院药物鉴定教研室鉴定，均为真品)。药物加水浸泡常规煎煮，过滤，水浴蒸发至每1 mL含生药3.75 g，置于4℃冰箱保存备用。秋水仙碱(云南医药集团云南药业有限公司生产)，二甲基亚硝胺(DMN，美国Sigma公司生产)，Ⅳ型胶原抗体(0.1 mL兔抗鼠浓缩型，武汉博士德生物制品公司生产)，免疫组化试剂盒(第四军医大学免疫组化室提供)。

    2  实验方法

    2.1  动物模型制备  大鼠在适应性饲养1周后随机选取8只作为空白对照组(A组)，其余58只均用DMN(用生理盐水稀释至5 mg/mL)以10 mL/kg体重腹腔注射，每日1次，每周连续3 d，连续4周。

    2.2  分组  4周造模结束后，58只大鼠共死亡8只，死亡率为13.7%，将剩余50只造模大鼠随机分为：B组(病理模型组)10只；C组(秋水仙碱组)10只；D组(中药大剂量组)10只；E组(中药中剂量组)10只；F组(中药小剂量组)10只。

    2.3  给药  A、B组：以生理盐水4 mL/只灌胃；C组：以秋水仙碱0.01 mg/kg体重灌胃；D组：以加味四逆散煎剂20 mL/kg体重灌胃；E组：以加味四逆散煎剂10 mL/kg体重灌胃；F组：以加味四逆散煎剂5 mL/kg体重灌胃。以上各组用药均1次/d，连续用药30 d后结束。

    2.4  标本采集与制备  实验结束时将大鼠断头处死取新鲜肝组织左叶，10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚5 μm。

    2.5  观测方法  将各组石蜡切片均行常规HE染色及胶原纤维染色，光镜下观察。病理组织学分级标准为［2］：“-”级，正常肝脏或无明显胶原纤维增生；“±”级，胶原纤维增生，中央静脉和汇管区有少量纤维索放散延伸，但无间隔形成；“+”级，胶原纤维增生，中央静脉和汇管区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔；“?”级，胶原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成(假小叶)；“?”级，完全间隔较厚，假小叶大量形成。

    2.6  加味四逆散大、中、小剂量组中Ⅳ型胶原免疫组化观察石蜡切片，免疫组化染色按试剂盒说明进行，SP染色法，DAB法显色。

    　　Ⅳ型胶原含量以半定量的分级方式，根据显色深浅，分布范围及密度，分别划为4个等级［2］。0级：阴性；1级：较少，着色浅，高倍镜下明确阳性；2级：少量，着色中等，低倍镜下明确阳性；3级：大量，条索状或小片状分布，着色深。

    3  实验结果

    3.1  加味四逆散大、中、小剂量对大鼠症状表现的影响  实验期间空白组大鼠一直精神状态佳，皮毛光滑密泽，紧贴身体，大便正常，进食无异常。所有造模组大鼠，则出现不同程度的精神不振，反应迟钝，饮食摄水明显减少，粪便稀薄，皮毛凌乱，缺乏光泽；治疗组于治疗3周后，大便逐渐干燥，进食、摄水增加，精神状态亦随之好转。其中中药中剂量组和秋水仙碱组恢复较快，中药大剂量组和小剂量组恢复较慢。

    3.2  加味四逆散大、中、小剂量对肝纤维化组织病的影响  实验结束后，光镜下观察可见，空白对照组：HE染色见肝组织结构清晰，胶原纤维染色仅于汇管区和中央静脉有少许胶原纤维存在。模型组：HE染色见肝组织结构欠清晰，汇管区及小叶内中度炎性细胞浸润；胶原纤维染色显示汇管区大量胶原沉积，呈较宽的条索状纤维深入肝小叶。各组大鼠仅见轻度汇管区炎症，胶原纤维染色显示纤维结缔组织增生程度减轻，以中药中剂量组和秋水仙碱组作用明显，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)，中剂量组与大、小剂量组比较有显著性差异(P＜0.05)，而小剂量组与大剂量组比较无显著性差异(P＞0.05)，见表1。表1  肝纤维化各组大鼠肝脏病理组织学变化注：#与B组比较P＜0.05，▲与D、F组比较P＜0.05，△与D组比较P＞0.05。

    3.3  加味四逆散大、中、小剂量对肝纤维化大鼠Ⅳ型胶原的影响  实验结束后免疫组化结果显示，中药中剂量组肝脏Ⅳ型胶原沉积较大剂量及小剂量组为少，统计学分析有显著性差异(P＜0.05)；而小剂量组稍优于大剂量组，但二者之间统计学分析无显著性差异(P＞0.05)，见表2。表2  大、中、小剂量组大鼠中Ⅳ型胶原的等级分布注：#与D、F组比较P＜0.05，△与D组比较P＞0.05。

    4  小结

    　　肝纤维化是向肝硬化的必经阶段，目前，大量的表明肝纤维化是可逆的病理过程［3?7］，因此阻断延缓或逆转肝纤维化的发生发展是治疗肝硬化的关键。减少胶原在细胞内的沉积可有效的阻止肝纤维化。加味四逆散已经证明可有效地减少胶原在细胞内的沉积，实验结束后动物一般症状表现显示，加味四逆散中剂量组大鼠活动度较好，皮毛较密集光泽，饮水、进食情况良好，粪便较干燥，而小剂量组及大剂量组较中剂量为差。免疫组化结果亦显示加味四逆散中剂量组对Ⅳ型胶原的降解作用最强，与大、小剂量组相比有显著性差异(P＜0.05)，提示该方用量并非越大越好，存在有效剂量范围，其量效机制尚待进一步探讨。

【文献】
  ［1］孙守才,刘光炜.加味四逆散治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的初步研究［J］.陕西中医学院学报,2001,24(1):46?47.

［2］施光峰,翁心华,徐肇癑,等.秋水仙碱对血吸虫病肝纤维化小鼠肝脏Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原蛋白表达的影响［J］.中华传染病杂志,2000,18(3):180?182.

［3］李益忠,刘旭东,黄 彬,等.行气活血饮治疗慢性乙型肝炎肝纤维化42例［J］.吉林中医药,2005,25(7):28.

［4］栗广辉.软肝消痞口服液抗肝纤维化的临床研究［J］.吉林中医药,2003,23(7):9?11.

［5］王劲松.肝纤溶颗粒治疗肝纤维化30例［J］.长春中医药大学学报,2007,23(8):50.

［6］陈 新.α1b?干扰素白蛋白诱导大鼠免疫肝纤维化的抑制作用［J］.实用肝脏病杂志,2007,10(5):303?305.

［7］金 博,廖 丹,孙 涛,等.人工虫草菌丝及锌减少肝纤维化大鼠肝脏胶原的沉积［J］.天津医药,2007,10(35):761?763.