贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷、芒果苷HPLC法含量测定

         作者：张秀桥，黄凤娇，陈家春　刘焱文

【摘要】  目的  建立高效液相色谱法测定贵州獐牙菜药材中獐牙菜苦苷、芒果苷2种成分含量的方法。方法  色谱柱为Alltimal C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水（水中含0.05%磷酸），梯度洗脱，流速1ml/min，检测波长254nm，柱温30℃。结果  獐牙菜苦苷（swertiamarin）、芒果苷（mangiferin）分别在3.10～30.98μg、0.31～2.78μg范围内线性良好，相关系数分别为0.9991、0.9993；平均回收率分别为99.00%、99.84%，RSD分别为2.66%、3.82%(n=6)。结论  该方法操作简便，分离度好，为完善贵州獐牙菜药材的质量标准提供了依据。

    【关键词】  贵州獐牙菜；HPLC；獐牙菜苦苷；芒果苷；含量测定

       Determination of swertiamarin and mangiferin in Swertia kouitchensis by HPLC

    【Abstract】  Objective  To establish a HPLC method for determination contents of swertiamarin and mangiferin  in  Swertia kouitchensis.Methods  Chromatographic column:Alltimal C18 column (250mm×4.6mm，5μm).Mobile phase: methanol-water (including 0.05% H3PO4)，and gradient elution.Flow rate: 1ml/min.Wavelength:254nm. Column temperture: 30℃.Results  The calibration curves of swertiamarin and mangiferin were in good linearity over the range of 3.10～30.98μg，0.31～2.78μg (r=0.9991，0.9993).The average recoveries were 99.00%，99.84% with RSD 2.66%，3.82%(n=5). Conclusion  It is a simple and sensitive method in controlling the quality of Swertia kouitchensi.

    【Key words】  swertia kouitchensis； HPLC； determination；swertiamarin；mangiferin

    贵州獐牙菜来源于龙胆科獐牙菜属植物Swertia kouitchensis Franch，主要分布于四川西阳、涪陵、南川；湖北恩施、宜昌等地，药用全草。其性寒、味苦；具有清热解毒、利胆退黄之功效，用于黄疸性肝炎、痈疽疔疮等［1～3］。研究表明，其主要含苦苷类、口山酮及其苷类、齐墩果酸等成分［4］，其中部分口山酮类成分具明显的体外抗乙肝病毒的活性［5］。本文研究了贵州獐牙菜中獐牙菜苦苷（swertiamarin，I）和芒果苷（1，3，6，7-四羟基-2-C-β-吡喃葡萄糖苷，mangiferin，II）含量测定方法，为评价其药材质量和疗效提供实验依据。

    1  实验仪器与试药

    1.1  仪器  美国Agilent1100高效液相色谱仪（G1311A泵、柱温箱、G1316A紫外检测器、Shemstation色谱工作站），Sartorius BP211D分析天平。

    1.2  试药  药材采自四川康定、花红树沟及湖北鹤峰，经华中科技大学同济医学院陈家春教授鉴定为龙胆科獐牙菜属植物Swertia kouitchensis Franch。

    对照品獐牙菜苦苷、芒果苷自提，HPLC色谱归一法测定纯度＞98%。甲醇为色谱纯，水为重蒸水，均经0.45μm滤膜滤过。

    2  方法和结果

    2.1  色谱条件及系统适应性试验  Alltimal C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-水（水中含0.05%磷酸），梯度洗脱，0～25 min，甲醇由20%增至50%；流速1ml/min，检测波长254nm，柱温30℃。理论塔板数均＞104，对称因子0.95～1.05。

    2.2  对照品及样品溶液的制备

    2.2.1  对照品溶液的制备  分别精密称取对照品獐牙菜苦苷、芒果苷一定量，混合后用甲醇超声溶解并定容，制成浓度分别为1.549、0.153 mg/ml的溶液，经0.45μm滤膜滤过，滤液作为对照品溶液。

    2.2.2  样品溶液的制备  取贵州獐牙菜全草0.5kg，置45℃烘箱干燥至恒重，粉碎，过80目筛，混合均匀后取约0.25g，精密称定。用约8ml甲醇浸泡过夜，超声提取2次，每次30min，滤过。合并滤液，滤液水浴蒸干后用甲醇定容至10ml，经0.45μm滤膜滤过，滤液作为样品溶液。

    2.3  方法学考察

    2.3.1  线性关系考察试验  取上述对照品溶液，分别进样2、4、8、10、12、16、18、20μl（n=2），以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标进行回归，獐牙菜苦苷回归方程为Y=594.29X+127.34，r=0.9991，进样量在3.10～30.98μg范围内线性关系良好；芒果苷回归方程为Y=4014.1X+274.1，r=0.9993，进样量在0.31～2.78μg范围内线性关系良好。

    2.3.2  精密度试验  取标准品溶液，重复进样5次，每次10μl，以峰面积獐牙菜苦苷、芒果苷的RSD分别为0.93%、1.24%，结果表明精密度良好。

    2.3.3  重复性试验  取同一批样品5份，按2.2.2项下制备样品溶液并测定含量，以含量计算獐牙菜苦苷、芒果苷的RSD分别为0.48%、1.48%，结果表明重复性良好。

    2.3.4  稳定性试验  取同一样品溶液，在一天内分别于0、2、4、8、12h进样，以峰面积计算獐牙菜苦苷、芒果苷的RSD分别为0.45%、1.45%，结果表明样品溶液在12h内稳定。

    2.3.5  加样回收试验  取已知含量同一批贵州獐牙菜全草6份，精密称定，分别加入獐牙菜苦苷、芒果苷标准品适量，按2.2.2项下制备，计算回收率，平均回收率分别为99.00%、99.84%，RSD分别为2.66%、3.82%(n=6)。见表1。 表1  两种化合物回收率试验结果  (略)

    2.4  样品测定  取不同产地的样品各3批，2.2项下制备样品溶液，根据测定成分的线性范围进样，测定峰面积，由对应的线性方程计算其含量，结果见表2。对照品溶液及样品溶液的HPLC色谱图见图1。表2  样品测定结果  (略）

    3  讨论

　3.1  样品溶液制备方法的选择  试验考察了甲醇回流提取和超声提取等条件下的提取率，结果提示回流提取时苦苷类成分部分被破坏，故采用超声提取。超声提取时考察了药材粉碎度以及是否浸泡过夜的提取率，结果提示过80目筛后甲醇浸泡过夜，再超声提取2次，每次30min，提取完全。

    3.2  色谱条件的选择及优化  试验考察了以下色谱系统：甲醇-水，甲醇-水-磷酸，乙腈-水，乙腈-水-磷酸，所得的色谱图以甲醇-水（水中含0.05%磷酸）梯度洗脱为最佳。A 对照品；B 贵州獐牙菜全草图1  对照品及贵州獐牙菜药材的HPLC图谱（略）

    3.3  检测波长的选择  獐牙菜苦苷VU最大吸收波长234nm，芒果苷最大吸收波长为257nm，当药醇苷最大吸收波长为253nm，故选择检测波长为254nm。

    3.4  样品测定结果  表明四川、湖北两地所产贵州獐牙菜均含獐牙菜苦苷、芒果苷，但四川所产贵州獐牙菜含獐牙菜苦苷量较高。

    【】

    1  余放争，董光平.獐牙菜属中的药用植物及其药理和化学研究综述.民族民间医药杂志，1998，36（4）：53-55.

    2  陈家春，万定荣，难波恒雄.獐牙菜属民族民间药物的整理.中国民族民间医药杂志，1999，总37：98-101.

    3  陈家春，俞伟，蔡大勇.獐牙菜属药用植物的研究及应用概况.中西医结合肝病杂志，1998，8（增刊上）：223.

    4  周青，陈家春，刘焱文.贵州獐牙菜化学成分研究.中药材，2004，27（12）：908.

    5  张秀桥，黄凤娇，陈家春，等.獐牙菜中口山酮类提取物抗HBV体外实验研究.中药材，2006，29(7)：697.