PLA表位肽免疫微球诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤作用

                作者：陈玮　蔡美英　曹伟民　魏大鹏

【摘要】  　　目的 考察载肽聚乳酸微球（PLA）体外诱导特异性CTL杀伤活性。方法 采用标准51Cr释放法检测CTL杀伤活性。结果 免疫微球M1、M2在体外均能刺激人PBMC增殖，形成大量可见克隆；CTL杀伤分析结果显示，免疫微球M1、M2诱导的效应细胞对荷肽T2细胞（T2+P）、HepG-2和Alexander的杀伤率均达75％以上，二者的杀伤活性没有明显差异（P＞0.05）。它们对表达hAFP的肝癌细胞HepG-2和Alexander的杀伤率均显著高于不表达hAFP的膀胱癌细胞BTT和未荷肽的T2细胞，差异明显（P＜0.001）。结论 免疫微球M1、M2均能在体外诱导产生特异性CTL，并对表达靶抗原的肿瘤细胞有较强杀伤作用。

【关键词】  聚乳酸微球；肝癌细胞；CTL表位；杀伤

    Abstract：Objective To survey the cytotoxicity of the CTL induced in vitro by PLA microspheres containing CTL epitopes derived from hAFP.Methods The specific cytolysis for hepatocellular carcinoma cell was assessed by 51Cr-release method.Results Two kinds of microparticles(M1、M2)containing CTL epitopes derived from hAFP induced HLA-A2+ PBMC from healthy volunteer to produce cell proliferation and form abundant visible clones;The cytolytic rate for hAFP+ tumor cells was over 75%.Which were significantly higher than HAFP- cells （Ｐ＜0.001）.And there was no significant difference between cytotoxicity of effector cells induced respectively by M1 and M2 (P＞0.05).Conclusion Two kinds of microparticles have potent capability to induce specific CTL in vitro and kill hAFP+ tumor cells effectively.

    Key words:PLA microsphere；hepatocellular carcinoma cell；CTL epitopes；cytotoxicity

　　 肝癌是严重威胁人类生命和健康的肝脏恶性肿瘤，临床效果不理想［1］。长期以来，人们一直致力于肝癌免疫治疗的探索。目前，基于表位的肿瘤CTL疫苗设计已成为肿瘤免疫治疗研究的重要内容［2］。由于大多数人的肝癌细胞都有较高水平的甲胎蛋白（human alpha-fetoprotein, hAFP）表达，本研究以hAFP为靶抗原，采用可生物降解的有机高分子材料聚乳酸(polylactic acid, PLA)，制备PLA包封的CTL表位肽免疫微球，检测其体外诱导的特异性CTL对肝癌细胞的杀伤活性，为进一步研究其体内免疫效应和机制提供实验基础［3］。

    1  材料与方法

    1.1  材料和仪器

    HLA-A2限制的CTL表位hAFP158－166、hAFP218－226由本室确定，表位肽由西安美联公司合成、纯化、鉴定；聚乳酸（PLA Mr 75 000～90 000），院成都有机化学研究所曹伟民教授提供；Na251CrO4，PerkinElmer，USA；RPMI-1640，GIBCO；新生小牛血清，兰州民海生物工程有限公司；淋巴分离液，上海试剂二厂；MTT，华美生物工程公司；18～25岁HLA-A2健康志愿者；肝癌细胞Alexander、HepG-2，膀胱癌细胞BTT，为本室冻存保种；T2细胞［4］由美国耶鲁大学医学院哈佛休斯医学研究所Peter Cresswell教授惠赠，本教研室冻存保种，上述细胞株均用含10％小牛血清的完全RPMI-1640培养液,37℃，5％CO2孵箱培养；激光粒径测定仪，Malvern，UK；扫描显微镜，Amray，USA；高速离心机，Beckman；UV-120紫外分光光度计，日本岛津；真空干燥机，浙江黄岩机械厂；γ计数器，国营二六二厂；DG-3022酶标仪，国营华光电子管厂。

    1.2  方法

    1.2.1  表位肽hAFP158－166和hAFP218－226的合成与纯化鉴定  表位肽委托西安美联公司采用固相合成法合成，合成所得粗产品经反相高效液相色谱纯化，冷冻干燥即得多肽纯品，并取样进行纯度分析和质谱鉴定。

    1.2.2  荷肽PLA免疫微球的制备  采用溶剂挥发法制备微球。表位肽hAFP158－166与hAFP218－226的包封方法相同。称取80mg PLA溶解于10ml 二氯乙烷，加入0.2ml表位肽溶液（1mg/ml）,匀质器搅拌数秒，形成乳白色初乳，然后逐滴加入磁力搅拌下的20ml 5％PVA溶液之中。6min后，再加入40ml蒸馏水，继续搅拌，8h后离心洗涤3次，蒸馏水悬浮，测粒径。然后离心收集微球，部分做扫描电镜分析，其余冷冻干燥，辐照灭菌备用（四川省农科院生物核技术研究所进行）。

    1.2.3  PLA免疫微球体外特性检测  载药量和包封率的测定  取20mg微球溶解于2ml氯仿之中，完全溶解后，加PBS，漩涡混合器上充分混合后静置，使油、水相分离。收集水相。余下油相再重复处理1次，将两次所得水溶液混合，离心，取上清液，紫外光谱法测定微球的载药量，并包封率。

    免疫微球的体外释放  将微球分散于PBS中，经漩涡混合器充分混合后，37℃，200r/min，振荡器上振荡。分别在0、6、24、48、144、240、360、600h离心收集上清液，测定其紫外吸收，得出PBS介质中表位肽的含量。每次取样后，用新鲜PBS恢复体积，重新分散，振荡。

    1.2.4  免疫微球体外诱导特异性CTL及对肿瘤细胞的杀伤活性检测  体外特异性CTL的诱导  抽取HLA-A2＋健康志愿者外周静脉血10ml，肝素抗凝,不完全RPMI-1640溶液对倍稀释，无菌分离外周血单个核细胞，不完全RPMI-1640溶液洗涤3次（2000r/min，10min/次），然后完全RPMI-1640培养液，37℃，5％CO2孵箱分瓶培养。两种免疫微粒（M1,M2）用不完全RPMI-1640溶液分别配制为1mg/ml的溶液，加入分瓶培养的PBMC中诱导培养。7d后，密度梯度离心收集细胞。

    CTL杀伤活性检测  采用标准的51Cr释放法。将诱导的细胞调整浓度为4×105/ml，按100μl /孔加入96孔细胞培养板做效应细胞。收集对数生长期的T2细胞、Alexander细胞、HepG2细胞、膀胱癌细胞BTT，调整细胞浓度为4×106/ml；加入100μl Ci51Cr，置37℃、5%CO2孵育2h，轻摇数次，离心，完全RPMI-1640培养液洗涤并调整细胞数为2×104/ml（其中对T2细胞荷肽）作为靶细胞。实验分组：自发释放组，各孔均加入100μl完全RPMI-1640培养液，再加入100μl上述对应的靶细胞（2×104/ml）；最大释放组，各孔均加入100μl 1%Triton，再加入100μl上述对应的靶细胞；实验组，分别加入效应细胞悬液100μl，再加入100μl上述对应的靶细胞；每一实验孔均为3复孔。已上样的96孔细胞培养板置37℃、5%CO2孵育4h，吸取上清0.1ml,用γ计数器测cpm值。结果计算：51Cr释放率（%）=（实验组平均cpm－释放组平均cpm）/（最大释放组平均cpm－自然释放组平均cpm）×100％。

    2  结果

    2.1  表位肽hAFP158－166和hAFP218－226的合成、纯化、鉴定

    经反相高效液相色谱分析，表位肽纯度均达99％以上。其相对分子质量测定值hAFP158－1661 214.96和hAFP218－226968.53，与理论值（hAFP158－166Mr1 214，hAFP218－226Mr 968）相符。

    2.2  微球的体外特性

    微球的形态、大小  制备所得含表位肽hAFP158－166和hAFP218－226的微球（以下分别称为M1、M2）。经激光粒径分析仪测量，M1的平均粒径为3.51μm，M2的平均粒径为4.42μm，均小于5μm (见表1)。扫描电镜观察表明，两种微球表面光滑、饱满，质量较好（见图1）。

    微球载药量和包封率的测定  采用紫外光谱法，经标准曲线计算得出，微球M1、M2的载药量分别为8.11μg和7.12μg(peptide)/mg(MS)，包封率分别为75.16%和62.43％。

    微球的体外释放特性  载肽微球M1和M2的体外肽释放量，1d后分别约为总量的3.2%和1.5%，以后缓慢释放，到第24d其累计释放量分别达总量的15.2%和14.8%，两者差异不大（见图2）。

    从微球的肽累积释放曲线可以看出，表位肽从两微球缓慢、平稳释放，微球性质稳定。

    2.3  免疫微球的灭菌

    辐照处理的免疫微球经检测，无菌，且其特性无明显改变。

    2.4  免疫微球体外特异性CTL的诱导及杀伤活性检测    免疫微球M1、M2在体外均能刺激人PBMC增殖，形成大量可见克隆，在诱导7d，细胞活力旺盛时收获细胞进行CTL杀伤分析，结果显示，免疫微球M1和M2诱导的效应细胞对荷肽T2细胞（T2+P）、HepG-2和Alexander的杀伤率均在75%以上，二者对空载T2和BTT的杀伤率均在40％以下（见图3）。

    经统计分析，免疫微球MI、M2诱导产生的效应细胞对表达hAFP的肝癌细胞HepG-2和Alexander的杀伤率均显著高于不表达hAFP的膀胱癌细胞BTT和未荷肽的T2细胞（P＜0.001），而二者的杀伤活性没有明显差异（P＞0.05）。

    3  讨论

    基础研究表明，以特异性CTL杀伤为代表的细胞免疫在抗肿瘤免疫中起着重要作用。近年来基于表位的肿瘤CTL疫苗研究得到迅速，并成为肿瘤免疫研究的重要内容［1-2］。其中，人工合成的表位肽疫苗不仅能直接激活CTL，诱导特异性CTL应答，而且生物安全性高，操作简便，机理也清楚［5］。并在黑色素瘤、乳腺癌和卵巢癌等的免疫治疗中取得了一定的成效［6-8］。

    但由于表位肽免疫原性弱，直接注射效果往往较差，因此，合适的载体和佐剂对CTL表位肽疫苗的构建非常重要。聚乳酸(polylatic acid, PLA)是一种可生物降解的有机高分子材料，具有很好的生物相容性和适当的稳定性，对人体无毒。而且，PLA微球兼备载体和佐剂作用，可延缓被包裹或吸附的多肽在体内的降解，提高其免疫原性，增强免疫效应，常用于单剂量疫苗和口服疫苗的制备［3,9-11］。

    研究表明，粒径5μm左右的PLA免疫微球具有靶向网状内皮组织细胞的作用，能诱导产生细胞免疫和特异性CTL［12-13］。本研究以PLA为包封材料，荷载hAFP优势CTL表位肽（hAFP158－166和hAFP218－226），制备得到了具有良好特性、体积平均粒径3～5μm之间的免疫微球［14］。研究结果显示，两种免疫微球均能在体外刺激人外周血PBMC增殖，形成大量明显的增殖克隆；它们诱导的PBMC对表达hAFP的肝癌细胞HepG-2和Alexander的杀伤率均达70％以上，显著高于hAFP阴性的膀胱癌细胞BTT和未荷肽的T2细胞（P＜0.001），但两者的杀伤活性没有明显差异（P＞0.05），说明这两种免疫微球均能在体外诱导产生特异性CTL，并对表达靶抗原的肿瘤细胞有较强杀伤作用，可以用于抗肝癌疫苗的进一步研究。

    综上所述，本研究制备所得的两种PLA免疫微球，其形态大小合适，特性良好，在体外均具有较强的特异性CTL诱导能力，为疫苗的进一步研究提供了实验基础。而免疫微球的有效性尚需体内实验进一步确证，有关免疫微球与抗原递呈细胞的相互作用及其机理也有待深入探讨。

【】
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