民族药材白花丹体外抗肿瘤活性研究

              作者：颜晓燕　盛艳梅　辛志伟  '

【摘要】  　　目的 探讨白花丹体外抗肿瘤作用的活性部位。方法 MTT染色法对白花丹五种溶剂提取物体外抗肿瘤活性进行了初步的研究。结果 氯仿提取物对乳腺癌细胞（Bre-04）、神经癌细胞（N-04）、肺癌细胞（Lu-04）有较好的抑制生长作用，IC50分别为0.269 9 mg/ml、0.263 4 mg/ml、0.496 1 mg/ml，对肝癌细胞HepG2抑制作用差， IC50为0.937 9 mg/ml；白花丹石油醚提取部位对乳腺癌细胞（Bre-04）、神经癌细胞（N-04）、肺癌细胞（Lu-04）、肝癌细胞HepG2的IC50分别为0.590 2 mg/ml、0.572 5 mg/ml、0.793 8 mg/ml、0.637 4 mg/ml；乙酸乙酯提取物对肺癌细胞（Lu-04）有一定的抑制作用，IC50为0.734 3 mg/ml；水溶性提取物以及正丁醇提取物无明显抑制肿瘤作用。结论 白花丹氯仿提取部位、石油醚提取部位体外抗肿瘤作用较好，值得对其提取部位进一步分离纯化并研究其抗肿瘤作用机制。

【关键词】  民族药材；白花丹；抗肿瘤

    Abstract：Objective To observe the antitumor activities of different solution extracts of Plumbago zeylanica L.in vitro.Method MTT method was used to detect the inhibitory effects on four kinds of cancer cells.Results chloroform extracts had significant inhibitory effects on the breast cancer cell(Bre-04),the nerve cancer cell(N-04) and the lung cancer cell(Lu-04),IC50 were 0.2699mg/ml and 0.2634mg/ml,0.4961mg/ml respectively.IC50 of chloroform extract on the HepG2 was 0.9379mg/ml.IC50 of petroleum ether extracts on Bre-04,N-04,Lu-04 and HepG2 was 0.5902mg/ml,0.5725mg/ml,0.7938mg/ml,0.6374mg/ml；ethyl acetate extracts had fairly inhibitory effects on the Lu-04,IC50 was 0.7343mg/ml；n-butanol extracts and water-solubility extracts had notsignificant inhibitory effects on the four kinds of cancer cells.Conclusion The antineoplastic effective parts of Plumbago zeylanica L.were chloroform and petroleum ether extracts.

    Key words:ethnic medicine;Plumbago zeylanica L.;antitumor

    白花丹Plumbago zeylanica L.为蓝雪科蓝雪属植物，又名白雪花、白皂药、山波苓、一见消、乌面马、火灵丹、假茉莉、猛老虎、白花岩陀等。主要分布在东南亚地区和我国四川、福建、、广东、广西省等地区，为东南亚许多国家及我国多民族医用药材［1～3］。在民间有广泛的应用基础，药理作用广泛，其抗肿瘤作用有很大的研究开发价值。本实验对白花丹不同溶剂的提取部位进行了体外抗肿瘤活性筛选，以期能为进一步的开发利用提供实验依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  供试品  白花丹石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物以及水溶性提取物均由西南民族大学少数民族药物研究所提供。

    1.1.2  癌细胞株  乳腺癌细胞株（Bre-04）、神经癌细胞株（N-04）、肺癌细胞株（Lu-04）、肝癌细胞株（HepG2）由成都地奥制药有限公司惠赠。

    1.1.3  主要试剂及培养用液等  RPMI-1640培养基、DMEM（低糖）培养基（GIBCOBRL）；小牛血清（成都哈里）；胰蛋白酶（GIBCO）；MTT染料、DMSO（sigma）。

    1.1.4  主要仪器  CO2培养箱（Thermo3111美国）；荧光相差显微镜（LX-71日本）；板式酶标仪（ZS-2北京新风机电技术公司）

    1.2  方法［4，5］

    乳腺癌细胞（Bre-04）、神经癌细胞（N-04）、肺癌细胞（Lu-04）均用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养，肝癌细胞（HepG2）用含10%小牛血清的DMEM（低糖）培养基培养，两种培养基均含青霉素和链霉素，浓度为100IU/ml。细胞均置于37℃，5% CO2的培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。

    贴壁细胞用0.25%胰酶消化，悬浮于含10%小牛血清培养基中，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，用培养基将悬液稀释至约50 000个/ml的浓度。按每孔100 μl接种于96孔板中，置于37℃，5%CO2的培养箱中预培养24 h。

    次日加药，将待测物配成5个2倍稀释的浓度，96孔板每孔加80 μl培养基，20 μl药液，每个浓度3个复孔。正常对照细胞组加100 μl培养基，溶媒对照组加80 μl培养基，20 μl溶媒，加药后，继续置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。

    24～48 h后，96孔板每孔加50 μl MTT染料（5mg/ml），继续培养4小时后，终止培养，小心吸去孔内培养基，每孔加入150 μl DMSO，充分振荡后迅速于492 nm波长处用酶标仪测OD值，测时减去空白对照值。待测样品对肿瘤细胞的抑制率。

    2  结果

    样品在492 nm波长处测定OD值，数据分析采用CS 2000简明统计分析软件，以溶剂对照处理组的肿瘤细胞为对照组，不同浓度药物对肿瘤细胞的抑制率，以抑制率和浓度作直线回归计算，得到药物的半数抑制浓度IC50。表1  白花丹石油醚及氯仿提取物对体外培养的四种肿瘤细胞的抑制作用表2  白花丹水溶性及正丁醇提取物对体外培养的四种肿瘤细胞的抑制作用表3  白花丹乙酸乙酯提取物对体外培养的四种肿瘤细胞的抑制作用肿瘤细胞的抑制率（％）＝对照组平均A值－给药组平均A值〖〗对照组平均A值×100%

    实验中白花丹氯仿和石油醚提取物所用溶媒为PBS和DMSO的混合溶液，结果显示，溶媒对肿瘤细胞也有一定的细胞毒作用，以未经溶剂处理的肿瘤细胞为对照组，溶媒对肿瘤细胞的平均抑制率为24.06%，样品对肿瘤细胞的抑制率以溶剂处理的肿瘤细胞为对照计算而得。结果显示，氯仿提取物对乳腺癌细胞（Bre-04）、神经癌细胞（N-04）、肺癌细胞（Lu-04）有较好的抑制生长作用，IC50分别为0.269 9 mg/ml、0.263 4 mg/ml、0.496 1 mg/ml，对肝癌细胞HepG2抑制作用差，只有在最高的浓度时，与溶剂对照组比P＜0.01，IC50为0.937 9 mg/ml；白花丹石油醚提取部位对乳腺癌细胞（Bre-04）、神经癌细胞（N-04）、肺癌细胞（Lu-04）、肝癌细胞HepG2的IC50分别为0.590 2 mg/ml、0.572 5 mg/ml、0.793 8 mg/ml、0.637 4 mg/ml；乙酸乙酯提取物对肺癌细胞（Lu-04）有一定的抑制作用，IC50为0.734 3 mg/ml，对乳腺癌细胞（Bre-04）有一定的抑制作用，但无明显的剂量效应关系，对神经癌细胞（N-04）有较弱的抑制作用，无明显剂量效应关系，对肝癌细胞HepG2几乎无抑制作用；白花丹水溶性提取物高浓度时对乳腺癌细胞（Bre-04）有一定的抑制作用，无明显剂量效应关系，对神经癌细胞（N-04）在高浓度时有较弱的抑制作用，其IC50为5.822 2 mg/ml，对肺癌细胞（Lu-04）、肝癌细胞（HepG2）几乎无抑制作用；白花丹正丁醇提物高浓度对乳腺癌细胞（Bre-04）显示一定的抑制作用，IC50为3.536 1 mg/ml，对神经癌细胞（N-04）、肺癌细胞（Lu-04）、肝癌细胞HepG2无明显抑制作用。

    3  讨论

    恶性肿瘤对人类的健康威胁很大，同心血管疾病成为医学上的两大难关，每年大约有700万新增患者，约500万人死于癌症。目前对肿瘤的仍然是以放疗、化疗、手术治疗为主，近年来起来的生物治疗也显示出了强大的生命力。在肿瘤的药物治疗方面，由于开发治疗肿瘤的化学合成药物耗资巨大，因此从植物药、矿物药、动物药中寻找具有高效低毒的抗肿瘤活性的成分就成为抗肿瘤药物研究的一个热点。

    白花丹为我国多民族医药用的药材，在民间有广泛的临床应用基础。云南哈尼族及傣族、广西瑶族、维吾尔族、印度医生均用其治疗风湿性关节痛、跌打损伤、血淤经闭、痛经、症瘕积聚、痈疥、疮疥、癣癞、瘰疬、蛇咬、疟疾、目翳、迎风流泪等［６］。壮医用白花丹治疗上颌癌、齿龈癌、食道癌、胰腺癌、恶性淋巴瘤、外阴癌等。24例晚期鼻咽癌患者给予白花丹汤等治疗，结果有独特的疗效及优越性［7］。报道称白花丹提取物有抗肿瘤活性［3,8］，但国内外关于其抗肿瘤作用的实验研究报道比较少,未见对不同溶媒提取部位的抗肿瘤筛选。本实验对白花丹的不同溶剂提取部位进行了体外抗肿瘤活性筛选，结果显示氯仿提物部位和石油醚提取部位抗肿瘤活性较好，与溶剂对照组比较，差异有统计学意义，但是IC50偏大，有必要对其进一步纯化。其抗肿瘤作用的机制也有待进一步探明。

【文献】
  ［1］赵辉，常新军.白花丹治疗体、股癣62例［J］.中医外治杂志，2003，12（3）：47.

［2］苏伟人.白花丹治疗皮肤瘙痒50例疗效观察［J］.民族民间医药杂志，1996，19：27.

［3］韦金育，李延，韦涛．50种广西常用中草药、壮药抗肿瘤作用的筛选研究［J］.广西中医学学报，2003，6（4）：3.

［4］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.第3版，人民卫生出版社，2002 北京：1 784-1 786.

［5］陈奇.中药药理研究方法学［M］.第2版，人民卫生出版社，2006 北京：1 012-1 013.

［6］刘园,钟熠,高泽文,等.白花丹药材的研究进展［J］.华西药学杂志，2006,21(1)71-73.

［7］邱宝珊.中医治疗24例晚期鼻咽癌的疗效观察［J］.新中医，1994,26(9)：10.

［8］赵艳丽，陆道培.白花丹醌对人急性早幼粒细胞白血病细胞的体外效应［J］.中国实验血液学杂志2006,14(2):208-210.